药物淋巴细胞刺激试验诊断抗结核药物所致超敏反应的临床价值研究

吴于青，代亮，陈雪花，廖永美

中国最新潜伏感染调查显示，至少有2亿～3亿人感染了结核分枝杆菌，我国现有500万肺结核患者，按照5%～15%的结核病发病风险进行估算，我国将可能产生4 000万新的活动性结核病患者［1］。终止结核病流行，及时诊断治愈每一例结核病患者尤为重要。

超敏反应是结核病患者在治疗过程中常见的不良反应之一，约占抗结核药物不良反应的15%［2］；按Gell-Coombs分类方法，超敏反应分为速发型（Ⅰ型）、细胞毒型（Ⅱ型）、免疫复合物型（Ⅲ型）、迟发型（Ⅳ型）超敏反应，而抗结核药物所致超敏反应主要表现为迟发型（Ⅳ型）超敏反应［3］。药物斑贴试验因灵敏度、特异度均较低临床已较少采用，目前临床诊断抗结核药物所致超敏反应主要依靠药物激发试验（DPT），然而由于抗结核药物常是联合应用，其可再次引发超敏反应甚至剥脱性皮炎，不仅延长患者的住院时间，同时增加患者的痛苦，一定程度上打击其治疗疾病的信心，极不利于我国结核病的防控。因此，如何快速、安全、准确地找出致敏药物是临床医师亟需解决的难题。本研究旨在探究药物淋巴细胞刺激试验（DLST）诊断抗结核药物所致超敏反应的灵敏度、特异度，为今后全面开展抗结核药物所致超敏反应的体外检测方法奠定基础。

1 资料与方法

1.1 研究标准

1.1.1 纳入标准 （1）符合2013年中华医学会结核病学分会《肺结核诊断和治疗指南》［4］中初治肺结核的相关诊断标准。（2）临床表现及实验室检查符合2010年《临床皮肤病学》［5］中药物所致超敏反应的诊断，并由2名专科医师共同诊断为药物所致超敏反应。

1.1.2 排除标准 （1）合并HIV感染者；（2）合并慢性肾脏病、糖尿病、造血系统疾病及自身免疫性相关疾病者；（3）接受抗结核治疗的同时在服用其他疾病治疗药物。

1.1.3 剔除标准 已纳入患者符合下列选项之一者予以剔除：（1）误诊、误纳；（2）抗过敏治疗过程中使用了免疫抑制剂。

1.2 一般资料 选取2015年1月—2016年12月在江西省胸科医院住院的初治肺结核治疗过程中发生超敏反应的患者60例，年龄21～62岁，平均年龄（40.8±7.0）岁。同期选取本院初治肺结核治疗过程中未发生超敏反应的患者60例作为对照组，年龄19～65岁，平均年龄（41.0±7.3）岁。两组患者性别（χ2=0.917）、年龄（t=1.532）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经江西省胸科医院伦理委员会审核批准，患者均知情同意。

1.3 方法

1.3.1 实验药物的制备 取患者已服用的可疑抗结核药物〔异烟肼（INH）、乙胺丁醇（EMB）、利福平（RFP）、吡嗪酰胺（PZA）〕的单次剂量，用5 ml双蒸水或二甲基亚砜（DMSO）剧烈震荡溶解，再用0.22 μm滤器过滤除菌，予RPMI-1640培养液稀释成3个浓度梯度（1∶10、1∶100、1∶1 000）。

1.3.2 外周血单核细胞（PBMC）分离 患者入组后在规定时间内留取10 ml静脉血备检，采用密度梯度离心法从患者肝素抗凝的血标本中分离PBMC，1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，重悬于2 ml RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清+青链霉素）并计数，调整细胞浓度为1×106/ml。在96孔板每孔加入1×105/100 μl PBMC，再加入预先制备的刺激药物5 μl。分别设置阴性对照孔（相同浓度的药物溶解介质+培养液+PBMC）、阳性对照孔〔植物血凝素（PHA）5 μg/ml+培养液+PBMC〕和调零孔（仅为培养液），每组设3个复孔。同时，每次实验时均随机取1例对照组患者的抗凝血标本进行相同的实验。将培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱培养60 h，倒置显微镜下观察细胞生长状态。

1.3.3 DLST 培养60 h后，向每孔加入10 μl Cell Counting Kit-8（CCK-8）溶液，继续培养12 h后，用酶标仪测定各孔在450 nm处的光密度（OD），计算刺激指数（SI），SI=（刺激OD-调零孔OD）/（阴性对照孔OD-调零孔OD），SI≥1.80为阳性。对每种药物分别进行DLST，任意一种药物检测结果为阳性者，判定该患者为DLST阳性。如果阳性对照孔的SI＜1.80，或者3个复孔的偏差过大，则判定该药物的DLST结果不可靠，需重新检测。

1.3.4 导致超敏反应药物的判定 患者停药后超敏反应症状缓解并确定DLST结果后，进行DPT（临床判断何种药物所致超敏反应的金标准［6］），每种药物间隔时间3～4 d，试药期间一旦出现DPT阳性［6］，即可确定为该药物的超敏反应。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料以（x ±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DPT阳性和DPT阴性患者4种抗结核药物的SI比较 DPT阳性患者INH、EMB、RFP和PZA的SI均高于DPT阴性患者，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 DPT阳性和DPT阴性患者4种抗结核药物的SI比较（x±s）Table 1 Comparison of the SI of the four anti-tuberculosis drugs in DPT-positive and DPT-negative patients

2.2 DLST对抗结核药物所致超敏反应的诊断价值DPT共检出66例次抗结核药物所致超敏反应（其中4例次为EMB和RFP所致超敏反应，2例次为INH和EMB所致超敏反应）。DLST共检出4例次两种抗结核药物所致超敏反应（3例次为EMB和RFP所致超敏反应，1例次为INH和EMB所致超敏反应）。

DLST诊断INH、EMB、RFP、PZA所致超敏反应的灵敏度分别为52.38%、50.00%、43.48%、58.33%，特异度分别为97.98%、99.09%、97.94%、100.00%（见表 2～5）。

表2 DLST对INH所致超敏反应的诊断价值（例）Table 2 Diagnostic value of the DLST for INH-induced hypersensitivity

表3 DLST对EMB所致超敏反应的诊断价值（例）Table 3 Diagnostic value of the DLST for EMB-induced hypersensitivity

表4 DLST对RFP所致超敏反应的诊断价值（例）Table 4 Diagnostic value of the DLST for RFP-induced hypersensitivity

表5 DLST对PZA所致超敏反应的诊断价值（例）Table 5 Diagnostic value of the DLST for PZA-induced hypersensitivity

3 讨论

抗结核治疗过程中的药物不良反应是影响患者治疗进程和效果的关键因素。我国抗结核药物不良反应的发生率平均为15%，表现为肝功能异常、超敏反应、关节痛等［7-9］；其中超敏反应是抗结核治疗中最常见的不良反应之一。

目前临床上对于超敏反应的处理方法是暂时中断用药，待患者超敏反应消失后采取DPT找出导致超敏反应的抗结核药物，这样不仅延长患者的住院时间，同时加重患者的痛苦，打击患者治疗疾病的信心，甚至导致患者放弃治疗，极不利于我国结核病的防控。因此，寻求一种能快速、准确、安全地找出导致超敏反应的抗结核药物的检测方法，是结核病临床工作人员共同的努力方向。

迟发型（Ⅳ型）超敏反应通常是在摄入抗结核药物后数小时、数天甚至数周后发生，主要是由T淋巴细胞介导的免疫反应导致，由多种细胞因子参与。T淋巴细胞的活化在药物刺激后几分钟内开始，引发钙离子内流和转录因子表达增加。几小时后，细胞因子如白介素（IL）-2、IL-3、IL-4、干扰素（IFN）-γ、转化生长因子（TGF）-β和早期细胞活化标志受体如CD40L、CD69、CD25、CD71大量表达。T淋巴细胞活化后3～5 d，细胞进入功能分化期，分化为不同类型的T淋巴细胞（Th1、Th2、Th17）和产生不同类型的细胞因子（Th1、Th2、Th17型细胞因子），后者继而又进一步影响T淋巴细胞功能。体外实验就是基于以上活化过程，从膜表面标志受体表达上调、细胞因子产生增加、T淋巴细胞增殖到细胞毒性检测等，在不同阶段检测不同活化指标［10-14］。

本研究采用CCK-8溶液检测可疑药物刺激后T淋巴细胞增殖，取代既往研究者采用的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法［15］，操作简便、对实验室要求低、结果变异率小，且为水溶性，实验过程中不需要换液，尤其适合于悬浮细胞，且检测的OD与活细胞数线性相关［15］，目前该技术已成熟，且已设立明确的阳性标准。

本研究对DLST检测4种一线抗结核药物（INH、EMB、RFP、PZA）所致超敏反应的诊断价值进行了分析，结果发现，DLST在诊断何种抗结核药物所致超敏反应中具有一定意义，主要表现为高特异度（均在97.00%以上），且灵敏度较3H-TdR渗入法高［16］，但总体来说灵敏度还是偏低（＜60.00%），考虑可能原因为：（1）药物所致超敏反应的病理机制是复杂的，T淋巴细胞免疫并不能完全涵盖各种药物所致超敏反应的原因；（2）本研究入组患者入院后在皮疹发生后的短时间内即留取静脉血，考虑存在药物洗脱期的影响。今后将在患者发生超敏反应后的不同时期内联合多种体外检测方法进行检测，预计将提高灵敏度。

综上所述，DLST在诊断患者因何种抗结核药物所致超敏反应时具有较高的特异度，虽然灵敏度稍低，但对指导临床用药仍意义重大。