恩诺沙星在大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内代谢动力学研究

何 欣，王 扬，贝亦江

(1.杭州市农业科学研究院 实验中心，浙江 杭州 310024；2.浙江省水产技术推广总站，浙江 杭州 310012)

大口黑鲈(Micropterussalmoides)，俗称加州鲈鱼，隶属鲈形目(Perciformes)鲈亚目(Porcoidei)太阳鱼科(Cehtrachidae)黑鲈属(Micropterus)。自20世纪80年代初由北美引进后，因其肌肉营养价值丰富全面、味道鲜美可口、生长快、易起捕，现已推广到全国各地，成为我国新的重要的水产养殖品种之一。然而，由于大口黑鲈引进时主要由野生种驯化而成，经多年近亲繁育和集约化养殖，种质退化和抗病能力降低等问题日渐突出。

养殖过程中抗生素的不合理使用是影响水产品质量安全的主要因素。目前国内外对用抗生素治疗大口黑鲈疾病的研究报道较少，尤其是关于抗生素在大口黑鲈体内代谢残留的研究极少。因此，很有必要开展抗生素在大口黑鲈体内的代谢研究。

恩诺沙星是一种动物专用的广谱喹诺酮类抗菌药物，在原农业部235号公告中被作为许可用药，在牛、羊肌肉中最高残留限量为0.1 mg·kg-1[1]。恩诺沙星口服吸收好，血药浓度高且稳定，能广泛分布于组织中，其代谢产物为环丙沙星，仍有强大抗菌作用。恩诺沙星对水生动物常见的病原菌，如嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[2]、爱德华氏菌属(Edwardsiellatarda)[3]、摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii)[3]等的抗菌活性均较强，对由耐药性致病菌引起的严重感染有效，与其他抗菌素无交叉耐药性，现已广泛应用于大口黑鲈养殖过程中，如治疗迟缓爱德华氏菌病等[4]。

本研究采用口服连续给药的方式，研究大口黑鲈血浆、肌肉和肝脏中恩诺沙星的代谢动力学，以期为明确恩诺沙星在大口黑鲈养殖中的合理用药及休药期提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物与主要试剂

恩诺沙星原粉，浓度≥98%，河北大山动物药业有限公司；恩诺沙星标准品，纯度≥99%，Sigma公司；超纯水，采用MILL-Q超纯水仪制备，符合GB/T 6682—2008一级水的标准；甲醇、正己烷均为色谱纯，Sigma公司；无水硫酸钠，分析纯，经高温灼烧4 h后，置于密闭容器中备用；酸化乙腈，盐酸-水-乙腈体积比1∶1∶250配制；肝素钠，上海哈灵生物科技有限公司；三乙胺，阿拉丁试剂；磷酸，浓度≥99%，Sigma公司。

1.2 主要仪器

Waters Acquity UPLC型高效液相色谱仪，配有荧光检测器(FLR)，Waters公司；HY-4A型振荡器，常州澳华仪器有限公司；IKA MS3 digital型涡旋混合器，德国艾卡公司；KQ3200型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Fulgor TDL-5A型高速离心机，德国菲恰尔公司；OA-SYS N-EVAP 112型氮吹仪，美国Organomation公司；IKA T18 Basic型高速组织捣碎机，德国艾卡公司。

1.3 实验动物

健康大口黑鲈，80尾，体质量(205±40)g，采自浙江省水产技术推广总站的外塘(40 m×60 m)，体态正常，无明显外伤。经随机抽取检测，大口黑鲈体内未检出恩诺沙星。实验前，在温室大棚[30 m×50 m，气温(26±1)℃]的水池[5 m×3 m，水温(25±2)℃]中驯养7 d。驯养期间投喂不含恩诺沙星的普通饲料。

1.4 给药方式与剂量

将6 g恩诺沙星原粉(浓度不小于98.5%)用水溶解后，添加6 g饲料黏合剂，与10 kg饲料拌匀，阴暗处晾干。连续投喂给药5 d，每天的投喂量为鱼体质量的5%，相当于每尾大口黑鲈恩诺沙星30 mg·kg-1(以体质量计)的剂量。大口黑鲈每次摄食1～2 h，每次摄食结束后清理池塘，确保没有任何饲料悬浮。

1.5 采样时间与样品保存

采样时间点分别为给药后1、2、4、8、12、24、48、72、120、168、240、360 h。每个时间点随机采集6尾实验大口黑鲈，头胸部之间取血至少2 mL至肝素钠处理过的塑料离心管中，分离血浆。去鳞、去皮，沿脊背取肌肉，肌肉样品切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后，置于研磨机中研磨均匀。另取肝脏样品置于研磨机中研磨均匀。每一尾大口黑鲈的每个组织、血浆均单独制样，样品置-20 ℃冰箱保存，待测。

1.6 组织中恩诺沙星浓度测定方法

1.6.1 前处理方法

前处理方法参照《农业部(原)783号公告—2—2006 水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定 液相色谱法》，并作适当修改，具体如下：准确称取(1.00±0.01)g的样品于50 mL塑料离心管中，依次加入6 g无水硫酸钠和30 mL酸化乙腈，涡旋2 min混匀，将样品置于三角瓶中，摇床振荡20 min，再转入高速离心机中，相对离心力6 000g，离心10 min，去上清液重复提取一次，合并上清液，加入25 mL正己烷，振荡5 min，取乙腈层，旋转蒸干，用1.0 mL流动相溶解残渣，移入1.5 mL离心管中，相对离心力5 500g，离心5 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜过滤后待测。

1.6.2 色谱条件

流动相：0.05 mol·L-1磷酸三乙胺溶液-乙腈，体积比9∶1；检测器FLR；激发波长280 nm；发射波长450 nm；流速0.4 mL·min-1；色谱柱为Waters BEH C18柱，2.1 mm×100 mm(1.7 μm)；柱温40.0 ℃；流动相A为磷酸水溶液(0.01 mol·L-1)，流动相B为乙腈；流动相A、B比例为88∶12(体积比例)。

1.7 数据处理

采用3P97药动学软件处理数据，制作药时曲线图，拟合药动学房室模型，计算药动学参数。

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 恩诺沙星的色谱图

按照1.6节色谱条件，恩诺沙星保留时间为3.573 min，如图1所示。

2.1.2 标准工作曲线与定量限

移取恩诺沙星标准溶液，稀释成质量浓度分别为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μg·mL-1的恩诺沙星标准溶液，按仪器工作条件进行测定。在0.05～5.00 μg·mL-1浓度范围内，恩诺沙星浓度与峰面积的线性关系良好，定量限(信噪比>10)为0.05 μg·mL-1。

2.1.3 加标回收率

在大口黑鲈空白血浆、肌肉和肝脏中加入不同浓度的恩诺沙星标准品，如表1所示，平均加标回收率为70.3%～85.8%，相对标准偏差(RSD)为2.49%～8.57%，符合检测要求。

2.2 药时曲线分析

经过测定，每个时间点大口黑鲈血浆、肌肉、肝脏中恩诺沙星的浓度如表2所示，选取0～120 h作药时曲线(图2)。大口黑鲈血液中恩诺沙星浓度从1 h的7.740 μg·mL-1上升到4 h的峰值12.12 μg·mL-1，随后开始下降，至240 h仍能检测出0.065 μg·mL-1的残留量，从360 h起，未检出或检出含量低于检出限。肌肉中恩诺沙星浓度从1 h的12.18 μg·g-1下降到2 h的8.895 μg·g-1，随后上升，4 h达到峰值15.22 μg·g-1，之后一直下降，直至360 h仍能检测出0.079 μg·g-1的残留量。大口黑鲈肝脏中恩诺沙星浓度从1 h开始就迅速上升，至4 h达到峰值15.89 μg·g-1，随后开始下降，直至360 h仍能检测出0.170 μg·g-1的残留量。

图1 1 μg·mL-1恩诺沙星标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of 1 μg·mL-1 enrofloxacin

表1大口黑鲈各组织中加标不同浓度恩诺沙星的回收率和相对标准偏差

Table1Recovery rate and relative standard deviation of enrofloxacin in different tissues of largemouth bass(n=6)

加标浓度Spiked levels/(μg·mL-1)血浆Plasma加标回收率Recovery rate/%相对标准偏差RSD/%肝脏Liver加标回收率Recovery rate/%相对标准偏差RSD/%肌肉Muscle加标回收率Recovery rate/%相对标准偏差RSD/%0.176.56.4483.98.5779.52.490.575.16.1785.86.4375.46.991.070.34.3880.17.1377.45.075.078.86.0271.23.2277.26.48

2.3 药动学参数

投喂恩诺沙星后，大口黑鲈血浆、肌肉和肝脏中的恩诺沙星呈一室开放模型，药动学参数如表3所示，动力学方程如下：

C血液=6.889×(e-0.07511t-e-0.6390t)；

C肌肉=7.510×(e-0.02676t-e-0.2931t)；

C肝脏=5.332×(e-0.01700t-e-0.3372t)。

2.4 恩诺沙星在大口黑鲈体内的吸收与代谢残留

吸收半衰期[T1/2(Ka)]是衡量药物吸收速率的重要参数。研究显示，恩诺沙星在多种暖水性鱼类中的吸收均较快：(25±2)℃下，在眼斑拟石首鱼血浆中的吸收半衰期为0.477 h[5]；18 ℃下，在黑鲪肌肉和血液中的吸收半衰期分别为2.015 h和2.173 h[6]；24～26 ℃下，异育银鲫血液、肌肉和肝脏中的吸收半衰期分别为2.92、14.03、8.55 h[7]。恩诺沙星在冷水性鱼类中的吸收较慢：23～25 ℃下，欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)血浆、肌肉和肝脏中的吸收半衰期分别为11.28、56.39、51.82 h[8]；(20±1)℃下，杂交鲟血液、肌肉和肝脏中的吸收半衰期分别为6.861、3.794、44.88 h[9]。消除半衰期是血浆药物浓度下降一半所需要的时间，其长短可反映体内药物消除速度。目前，关于恩诺沙星在水产动物体内的消除半衰期已有较多报道，结果显示，消除半衰期受种属及水温影响极大。

表2给药后不同时间大口黑鲈各组织中恩诺沙星的浓度和相对标准偏差

Table2Concentrations and relative standard deviations of enrofloxacin in different tissues of largemouth bass (n=6)

t/h血浆Plasma浓度Concentration/(μg·mL-1)RSD/%肝脏Liver浓度Concentration/(μg·mL-1)RSD/%肌肉Muscle浓度Concentration/(μg·g-1)RSD/%17.74011.345.4289.3612.1814.2228.0887.6211.569.238.89510.45412.124.6515.8910.6215.227.2184.3148.1313.1314.5610.3910.39123.79915.897.97813.908.30913.58242.12332.785.90522.397.00128.09482.02125.182.54131.084.87429.67721.4008.312.4176.382.59211.71960.58215.401.83213.421.24417.381200.23612.550.90815.780.7579.231680.09517.320.5827.750.43014.902400.0657.510.2437.560.1918.02360000.17012.330.0795.80

图2 恩诺沙星在大口黑鲈体内的药时曲线Fig.2 Concentration-time curve of enrofloxacin in largemouth bass

如表3所示：本研究中连续5 d投喂30 mg·kg-1剂量的恩诺沙星后，恩诺沙星在大口黑鲈血浆、肌肉和肝脏组织中的吸收半衰期分别为0.998、2.176、1.892 h，消除半衰期分别为8.494、23.84、37.53 h，血液中的药时曲线下总面积为132.23 μg·mL-1·h，肌肉和肝脏中的药时曲线下总面积分别为273.50、247.12 μg·g-1·h。血液中表观清除率为0.018 89 μg·mL-1·h-1·(μg·mL-1)-1，肌肉、肝脏中表观清除率分别为0.013 12、0.017 81 μg·g-1·h-1·(μg·g-1)-1。血液中的中央室表观分布容积为1.893 0 μg·mL-1·(μg·mL-1)-1，肌肉和肝脏组织中的中央室表观分布容积为1.0842、2.9329 μg·g-1·(μg·g-1)-1。恩诺沙星在大口黑鲈血浆、肌肉和肝脏组织中的达峰时间均为4 h，对应的峰值浓度分别为12.12 μg·mL-1、15.22 μg·g-1和15.89 μg·g-1，表明恩诺沙星在大口黑鲈体内的吸收与代谢速率均较快。

表3恩诺沙星在大口黑鲈各组织中的药动学参数

Table3Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in different tissues of largemouth bass (n=6)

参数 Parameter单位Unit血浆Plasma肝脏Liver肌肉MuscleAμg·mL-1 [μg·g-1]6.8895.3327.510Keh-10.075110.017000.02676Kah-10.63900.33720.2931T1/2(Ka)h0.9981.8922.176T1/2(Ke)h8.49437.5323.84AUCμg·mL-1·h [μg·g-1·h]132.23247.12273.50CL/F(s)μg·mL-1·h-1·(μg·mL-1)-1 [μg·g-1·h-1·(μg·g-1)-1]0.018890.017810.01312V/F(c)(μg·mL-1) ·(μg·mL-1)-1 [(μg·g-1) ·(μg·g-1)-1]1.89302.93291.0842T(Peak)h444

单位中不加[ ]的是血浆中的单位，加[ ]的是肝脏和肌肉中的单位。A为分布相的零时截距；Ka为吸收速率常数；Ke为消除速率常数；T1/2(Ka)为吸收半衰期；T1/2(Ke)为消除半衰期；T(Peak)为达峰时间；AUC为药时曲线下总面积；CL/F(s)为药物的表观清除率；V/F(c)为中央室表观分布容积。

In the column of unit， unit listed before [ ] was used for indexes in plasma， while the unit listed in [ ] was used for indexes in liver and muscle.A， Intercept of distribution phase at 0 h;Ka， absorption rate constant;Ke， eliminate rate constant;T1/2(Ka)， absorption half-life;T1/2(Ke)， elimination half-life;T(Peak)， peak time; AUC， total area under drug time curve; CL/F(s)， apparent clearance; V/F(c)， apparent volume of distribution in central compartment .

2.5 多峰现象的研究与探讨

药动学研究通过组织中药物浓度-时间的变化，借助相关的数学模型和药动学处理软件，计算出一系列药动学参数，反映药物在体内的动态变化特征。在药时曲线图中，会出现双峰曲线或多峰曲线的现象，即有多个达峰浓度和达峰时间。一般认为，出现多峰现象的原因可能有：1)口服或灌胃给药时，药物在胃肠道中的多个位点被吸收，每个位点的吸收量与速率不同，在不同时间叠加形成血药中的多峰现象；2)药物的肝肠循环作用(hepato-enteral circulation)[10]，即胆汁排泄后的药物经胆汁排入十二指肠后，部分药物可再经小肠上皮细胞被重新吸收，在药动学上表现为药时曲线出现双峰，在药效学上表现为药物的作用时间明显延长，以及连续给药方式导致药时曲线图中出现双峰曲线或多峰曲线。连续多次给药可以维持药物在生物体内的浓度，同时使得浓度上下波动，间隔时间越长，波动越大。房文红等[8]开展了欧洲鳗鲡体内恩诺沙星及其代谢物环丙沙星的药动学研究，10 mg·kg-1剂量的恩诺沙星经过单次给药后进入欧洲鳗鲡体内，药时曲线中观察到多峰现象；张德云等[11]研究了日本鳗鲡体内恩诺沙星的药动学规律，连续投喂7 d，每天口服给药2次，每次剂量9 mg·kg-1，给药期间日本鳗鲡体内各组织中的恩诺沙星含量呈现多峰现象；Lewbart等[12]比较研究了单次口服给药和药浴方式下恩诺沙星在红水虎鱼血浆中的代谢动力学，结果表明，通过单次口服给药的红水虎鱼血浆中的药时曲线出现了四峰现象。本研究采用了30 mg·kg-1的剂量，连续5 d，每天投喂1次恩诺沙星，在大口黑鲈肌肉中同样出现了双峰曲线，表明恩诺沙星在大口黑鲈体内可能存在肝肠循环作用。

2.6 药效及休药期研究

喹诺酮类药物属于浓度依赖型抗菌药物，对水产养殖中常见的细菌性疾病的治疗效果与峰浓度(Cmax)/最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration， MIC)等参数有关。一般认为：Cmax/MIC>8时，药物即可起到良好的治疗效果；当Cmax/MIC=10时，可发挥最大治疗效果[13-14]。恩诺沙星对嗜水气单胞菌的MIC为0.5 μg·mL-1[15]，对迟缓爱德华氏菌的MIC为0.5 μg·mL-1[16]，对溶藻弧菌、最小弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌4种12株菌的MIC为0.1～0.8 μg·mL-1[17]。总结可知，恩诺沙星对大多数鱼致病菌的MIC在0.1～1.0 μg·mL-1，本实验表明，25 ℃下，当用30 mg·kg-1的剂量连续5 d混饲给药后，恩诺沙星在大口黑鲈血液、肝脏和肌肉中的Cmax分别为12.12、15.89、15.22 μg·g-1，Cmax/MIC的值均大于10，能够满足治疗需要。在实际用药时，应根据感染的菌种及发病期等因素对症下药，调整剂量及使用周期，以减少耐药性的产生。

休药期也叫消除期，可以反映动物从停止给药到许可屠宰或其乳、蛋等产品许可上市的间隔时间的长短。影响休药期的因素很多，有种属因素、环境因素等。原农业部第278号公告规定，恩诺沙星在禽类中的休药期为8 d，在牛、羊中均为14 d，在猪中为10 d，在兔中为14 d，但未规定其在水产品中的休药期标准。我国水产养殖的品种众多，使用的渔药种类及各种药物的制剂类型也较多，极有必要结合水产养殖的制剂水平和用药方式开展休药期研究。根据原农业部公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》(农牧发〔2002〕235号)，恩诺沙星牛、羊肌肉中的含量不得高于0.1 mg·kg-1，按此标准，本实验在360 h后，即15 d后，大口黑鲈可食部分肌肉中的恩诺沙星含量小于0.1 mg·kg-1。因此，在25 ℃的条件下，恩诺沙星在大口黑鲈体内的休药期为15 d。

3 结论

应用液相色谱技术测定了连续5 d口服30 mg·kg-1剂量的恩诺沙星后，不同时间点大口黑鲈体内各组织中恩诺沙星的含量，建立药时曲线，并通过3p97药动学软件进行数据处理，计算得到药动学参数，探讨恩诺沙星在大口黑鲈体内的代谢动力学规律。结果表明，30 mg·kg-1剂量(以体质量计)的恩诺沙星在大口黑鲈养殖中能够满足治疗的需要，25 ℃环境下建议的休药期为15 d。