不同贮藏条件下大黄鱼生物胺变化

朱作艺，张 玉王君虹李 雪王 伟，*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 320021；2.农业农村部创意农业重点实验室，浙江 杭州 310021)

生物胺(biogenic amine，BA)是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化合物[1]。过量生物胺会产生诸多不良反应，包括偏头痛、恶心、血压变化等，严重时导致休克而危及生命[2-4]。生物胺中毒性最大的是组胺，其次是酪胺[5-6]。研究表明：口服8～40 mg组胺导致轻微中毒，40～100 mg引起中度中毒，超过100 mg导致严重中毒，酪胺超过100 mg会引起偏头痛，苯乙胺超过3 mg则导致血压升高。此外，生物胺容易与亚硝酸盐反应生成致癌性物质亚硝胺[7]。目前已报道的生物胺产生途径主要是氨基酸脱羧和醛酮类化合物的氨基化作用[8-9]。生物胺广泛存在于水产品、肉类产品与发酵制品中[10-16]。欧盟、美国和我国对水产品中的生物胺均有相应的限量要求。

大黄鱼属于低组胺鱼类，是我国重要经济鱼类。目前，大黄鱼贮藏过程中的品质变化主要研究pH值、挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)值、菌落总数、过氧化值、K值、感官评价等指标，针对其生物胺变化规律及与品质之间相关性的研究尚未见报道。目前，生物胺的测定方法主要有薄层色谱法[17]、气相色谱法[18]、离子色谱法[19]、液相色谱法[20-21]等。本研究采用离子色谱法测定生物胺，研究了不同温度(0、4、25 ℃)和不同盐分(0、0.5%、2.0%、5.0% NaCl)处理条件下大黄鱼中生物胺与贮藏时间的关系，并通过分析生物胺与腐败指标(TVB-N值)的相关性，研究生物胺与大黄鱼品质的关系，以期为控制大黄鱼生物胺生成、提高大黄鱼贮藏质量、保障其食用安全提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

大黄鱼购于杭州沃尔玛超市，产自福建宁德，属养殖品种，已于-18 ℃条件下冻结6 d，直接从冷库(-18 ℃)挑选个体均一(每条约400 g)、背部灰褐色、腹部金黄色的个体，冰藏条件下2 h内运回实验室。

Dionex ICS-3000离子色谱仪(Thermofisher)，配有DP双泵(带脱气装置)，DS6电导检测器，Chromeleon 6.8色谱工作站(用于软件控制及数据采集)；Ultimate 3000系列VWD-3X00 UV-VIS检测器(Thermofisher)；AS自动进样器(Thermofisher)；Dionex IonPac CG17(50 mm×4 mm)保护柱，Dionex IonPac CS17(250 mm×4 mm)分析柱；Dionex CSRS 300-4 mm电化学自再生抑制器；超纯水系统；涡旋混匀器；离心机；0.22 μm尼龙滤膜过滤头。

99%甲基磺酸(MSA)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；乙腈(色谱纯)，Merck公司；其他化学试剂均为分析纯，所有用水均为电阻率≥18.2 MΩ·cm去离子水。

标准品：组胺(histamine，His)，酪胺(tyramine，Tyr)，腐胺(putrescine， Put)，尸胺(cadaverine，Cad)，苯乙胺(phenylethylamine，Phe)，亚精胺(spermidine，Spd)，精胺(spermine，Spe)，均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 样品制备

将大黄鱼破腹，去内脏、去头、去鳞、去皮，清洗干净，采用纵向剖片方式取大黄鱼肉片，沥干后装入聚乙烯自封袋中。取部分大黄鱼肉片，分成3组，分别于0、4、25 ℃下贮藏，0、4 ℃贮藏16 d，25 ℃贮藏6 d。另取部分大黄鱼肉片，分成3组，根据肉片质量称取一定量的NaCl(分别占肉片质量的0.5%、2.0%、5.0%)，涂抹于肉片表面，于25 ℃贮藏6 d。

1.3 生物胺测定方法

1.3.1 标准储备液和标准工作液的配制

分别准确称取50 mg上述7种生物胺标准品，置于50 mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀后分别得到浓度为1 000 mg·L-1的各种生物胺标准储备液，将储备液于4 ℃避光保存。分别吸取上述标准储备液，用10 mmol·L-1的MSA溶液稀释，配制不同浓度的生物胺混合标准工作溶液，用于制作标准曲线，对大黄鱼样品中生物胺进行定量。

1.3.2 淋洗液配制

配制0.1 mol·L-1MSA溶液(用于梯度淋洗脱)：吸取6.5 mL的99% MSA，用去离子水定容至1 L，采用0.45 μm微孔水膜过滤，超声脱气15 min。

1.3.3 色谱条件

阳离子交换色谱柱：Dionex Ionpac CG17保护柱(50 mm×4 mm)+Dionex Ionpac CS17分析柱(250 mm×4 mm)。流动相：0～12 min， 10 mmol·L-1MSA；12～25 min，10～35 mmol·L-1MSA；25～30 min，10 mmol·L-1MSA。流速：1.0 mL·min-1；柱温30 ℃。自再生电化学抑制模式，抑制器设置电流103 mA。检测方式：抑制电导与紫外串联检测；电导检测池温度：35 ℃；紫外检测波长：276 nm(用于检测酪胺)；进样量：25 μL。外标法峰面积定量。

1.3.4 样品前处理

大黄鱼肉片样品在匀浆机上彻底粉碎匀浆，取5.0 g待测样品加入50 mL的10 mmol·L-1MSA，超声提取30 min，冷冻离心机(4 ℃，8 500g)离心10 min，取上清液5 mL，加5 mL乙腈涡旋混匀，离心后取上层液体4 mL用去离子水稀释至10 mL，混匀后过0.22 μm滤膜，然后进样上机。

1.4 挥发性盐基氮的测定

不同温度、盐分贮藏条件下大黄鱼的TVB-N值参照GB/T 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的第二法——自动凯氏定氮法进行测定。

2 结果与分析

2.1 生物胺的色谱分离检测

本研究建立阳离子交换色谱分离-抑制型电导-紫外串联检测腐胺、尸胺、组胺、亚精胺、苯乙胺、精胺、酪胺7种生物胺的方法。由于酪胺经抑制后无电导信号，但酪胺具有较强的紫外吸收，因此酪胺采用紫外检测，其他生物胺采用抑制电导检测。通过阳离子交换色谱柱进行分离，采用甲基磺酸溶液作为淋洗液进行梯度洗脱。结果表明，7种生物胺能达到较好的分离效果(图1)。7种生物胺在0.1～100 mg·L-1内线性关系良好，线性相关系数均大于0.999 0，方法检出限介于0.35～1.76 mg·kg-1，样品加标回收率均介于88.2%～108.8%，方法精密度(RSD)小于4.1%(n=6)，表明该方法简单、方便，具有较好的重现性和准确性，适用于大黄鱼中生物胺的测定。

2.2 不同贮藏温度下大黄鱼中生物胺的含量

温度对大黄鱼肌肉组织中生物胺的产生有重要影响，温度越高，生物胺产生速度越快。从表1可知，大黄鱼在0、4 ℃贮藏16 d，生物胺总量的变化范围分别为1.41～17.53、1.53～187.63 mg·kg-1，在25 ℃仅贮藏6 d，生物胺总量的变化范围为9.44～2 539.22 mg·kg-1。大黄鱼整个贮藏过程中均未检出His和Spe，而Spd本身存在于肌肉组织中，全程均有检出，其含量随着贮藏时间出现小幅波动变化。0 ℃贮藏条件下，1～16 d，Put和Spd均有检出，Tyr在第10天开始检出，整体呈缓慢增加的趋势。4 ℃贮藏条件下，除Cad和Tyr均从第6天开始有检出、Put和Tyr在贮藏后期增加趋势更为明显外，其他变化情况与0 ℃贮藏条件下相似。25 ℃贮藏条件下，Put、Cad和Tyr随着贮藏时间的延长急剧增加，生物胺总量在第2 天就由9.44 mg·kg-1迅速升高至306.26 mg·kg-1左右。由此说明，温度越高，生物胺产生越快。在整个贮藏过程中，Cad的变化尤其显著，Spd在整个贮藏期间变化不显著，始终保持在较低水平。贮藏第4天开始有Phe检出，在4～6 d为5.03～85.20 mg·kg-1。鉴于大黄鱼中生物胺含量较高且变化明显的为Put、Cad和Tyr，因此，这3种生物胺可作为评价大黄鱼鲜度品质的特征生物胺。Kanki等[22]认为，生物胺产生菌有嗜冷菌和嗜温菌2大类，鱼体在不同温度时带的菌不同，不仅高温时产生生物胺，低温时也能产生生物胺，只不过低温时菌体代谢缓慢，生物胺的产量低。

TVB-N是新鲜肉组织受到外界微生物感染，由于微生物生长引起的脱羧、脱氨作用导致蛋白质分解而形成的产物，是水产品的一种特定腐败指标。由图2可知，不同温度贮藏条件下大黄鱼中的生物胺总含量与TVB-N值变化趋势整体一致，均随着贮藏时间的延长呈现上升的趋势。0 ℃条件下生物胺总量和TVB-N值缓慢上升；4 ℃条件下的生物胺总量和TVB-N值随着时间延长增加，明显高于0 ℃；25 ℃条件下的生物胺总量和TVB-N值随着时间的延长急剧增加，显著高于0 ℃和4 ℃，表明高温大大加快了大黄鱼的腐败速度。大黄鱼中生物胺在不同温度贮藏条件下与腐败指标TVB-N值变化趋势一致，由此表明，生物胺可以作为评价大黄鱼腐败程度的一种指标。

表1不同贮藏温度下大黄鱼中生物胺含量

Table 1 Content of seven BAs in large yellow croaker stored at different temperature mg·kg-1

“—”表示未检出。

—， Below detection limit.

图2 大黄鱼生物胺总量(A)与TVB-N(B)在不同贮藏温度下的变化情况Fig.2 Changes of total BAs (A) and TVB-N (B) in large yellow croaker stored at different temperature

2.3 不同盐分贮藏条件下大黄鱼中生物胺含量

将不同量的NaCl涂在鱼肉表面，于25 ℃贮藏，其生物胺含量见表2。不同盐分条件下整个贮藏过程中均未检出His和Spe，Spd含量变化范围较小(0.76～7.92 mg·kg-1)。Put、Cad和Tyr均随着贮藏时间延长而增加，Phe则在贮藏第4或5天出现。与空白对照组(不添加NaCl)相比，其他含量盐分贮藏条件下的生物胺均出现不同程度的下降，表明NaCl对大黄鱼中生物胺的生成有明显的抑制作用，而且盐浓度越高，对生物胺的抑制效果越好。大黄鱼在0、0.5%、2.0%和5.0% NaCl条件下贮藏6 d，其生物胺总量变化范围分别为9.44～2 539.22、2.82～2 050.34、4.60～1 305.95、1.32～120.93 mg·kg-1。NaCl对Put、Cad和Tyr有相似的抑制效果，但对Spd影响不大。与空白对照组相比，NaCl含量为0.5%时，各生物胺含量略微有些下降，但效果不明显；NaCl含量为2.0%时，3种特征生物胺含量相对空白对照下降50%左右；NaCl含量为5.0%时，Put、Cad、Tyr含量急剧下降，第6天时，Cad和Tyr含量分别为30.80、5.39 mg·kg-1，而此时空白对照组Cad和Tyr含量分别为1 533.50、469.80 mg·kg-1，同时Tyr的检出时间也逐渐延后，5.0% NaCl贮藏条件下直到第5天才有检出。Phe均在第4天后才有检出，随着NaCl含量的升高，Phe含量有所下降，当NaCl含量达5.0%时，大黄鱼肌肉中未检测到Phe。

表2不同盐分贮藏条件下大黄鱼中生物胺含量

Table 2 Content of seven BAs in large yellow croaker stored with different NaCl concentration mg·kg-1

由图3可知，不同盐分贮藏条件下大黄鱼中的生物胺总含量与TVB-N值变化趋势相似，均随着贮藏时间的延长呈现上升的趋势，随着NaCl含量升高，生物胺总量和TVB-N值不断下降，下降速度也随着盐浓度的增加而增大。当NaCl含量达5.0%时，生物胺总含量与TVB-N值抑制效果最明显，生物胺总量变化范围为1.32～120.93 mg·kg-1，TVB-N值变化范围为12.90～51.50 mg·100 mg-1。大黄鱼中生物胺在不同盐分贮藏条件下与腐败指标TVB-N值变化趋势一致，表明适当添加一定量的食盐进行贮藏可作为大黄鱼保鲜方法的一种选择。

图3 大黄鱼生物胺总量(A)与TVB-N(B)在不同盐分贮藏条件下的变化情况Fig.3 Changes of total BAs (A) and TVB-N (B) in large yellow croaker stored with different NaCl concentrations

3 结论

本实验研究了不同贮藏条件下大黄鱼中生物胺的变化情况，包括0、4 ℃贮藏16 d、25 ℃贮藏6 d，以及不同盐分(0、0.5%、2.0%、5.0% NaCl)于25 ℃贮藏6 d，大黄鱼肌肉组织中7种生物胺含量和相对应的腐败指标TVB-N值的变化情况。25 ℃条件下，大黄鱼肌肉中生物胺和TVB-N值明显高于0、4 ℃贮藏，特征生物胺Cad、Put和Tyr含量显著增加，并随着贮藏时间延长含量远大于其他生物胺，Phe含量在贮藏后期升高较快，Spd含量基本保持稳定。通过添加不同含量NaCl进行贮藏，在25 ℃条件下，Cad、Put、Phe和Tyr含量均显著降低，其降低速度随NaCl含量升高而增加，当NaCl含量达5.0%时，大黄鱼中生物胺和TVB-N值均明显低于其他贮藏组，生物胺抑制效果显著。综上，高温导致生物胺的急剧累积和TVB-N值的急剧增加，大黄鱼新鲜度显著降低，极易腐败，低温及适当添加食盐是控制生物胺产生的有效措施，有利于大黄鱼的贮藏保鲜。