登革病毒NS1抗原捕获酶联免疫吸附试验在登革热实验室诊断中的应用价值

王陈龙　何思杰　顾大勇　冯杰娥　何建安　曾庆洋

【摘要】 目的：旨在检测登革病毒NS1抗原捕获酶联免疫吸附试验在登革热实验室诊断中的应用价值，为登革病毒早诊早筛提供帮助。方法：选取2012-2016年间于本院就诊的疑似登革病毒感染患者的血清学标本共362例，通过过胶体金免疫层析法、荧光聚合酶链式反应以及NS1-ELISA试验对登革热诊断的灵敏度、特异性、阳性及阴性预测值、阳性及阴性似然比和约登指数等统计学指标进行比较。

结果：三种检测方法中，金标法具有较高的检测率（64.64%），然而其灵敏度和特异性较差（分别为87.80%和65.61%）；NS1-ELISA试验具有较高的灵敏度（91.22%）、阴性预测值（87.50%）及约登指数（0.71）和较低的阴性似然比（10.94%）；qPCR法则具有较高的特异性（85.99%）、阳性预测值（88.72%）和阳性似然比（598.51%）。三种检测方法的灵敏度比较差异均无统计学意义（P>0.05）；金标法和qPCR法的特异性比较差异有统计学意义（P<0.01），其他无统计学意义（P>0.05）。结论：登革病毒NS1抗原捕获酶联免疫吸附试验的检测效能较优，在登革热的诊断中具有一定的应用价值，能够为登革热的早诊早筛提供帮助。

【关键词】 登革病毒； 酶联免疫吸附试验； 诊断

【Abstract】 Objective：To investigate the application significance of dengue virus NS1 antigen capture ELISA in the early diagnosis of dengue fever，in order to provide diagnostic and screening methods for clinical application.Method：Serum samples were obtained from 362 borderline cases of dengue virus infection in our hospital from 2012 to 2016.Exploite colloidal gold immunochromatography （GICT），quantative polymerase chain reaction （qPCR） and NE1 antigen capture ELISA （NS1-ELISA） were used to assess the sensitivity，specificity，positive and negative predictive value，positive and negative likelihood ratio and Youden index.Result：Compared with other test methods，the detection rate of the GICT had the highest value （64.64%），however， its sensitivity and specificity were relatively lower （87.80% and 65.61%， respectively）.NS1-ELISA had the highest sensitivity （91.22%），negative predictive value （87.50%） and Youden index （0.71） as well as the lowest negative likelihood ratio （10.94%）. qPCR had the highest specificity （85.99%）， positive predictive value （88.72%） and positive likelihood ratio （598.51%）.No significant differences were found in sensitivities among three methods（P>0.05）.The specificity between GICT assay and qPCR assay was statistically significant（P<0.01），but there were no significant differences among other comparison groups（P>0.05）.Conclusion：The detection efficiency of dengue virus NS1 antigen capture ELISA is relatively high，which has application value in the diagnosis of dengue fever and can offer assistance in the early diagnosis and timely screening of dengue fever.

【Key words】 Dengue virus； Enzyme-linked immuno sorbent assay； Diagnosis

First-authors address：Nanhai Hospital of Southern Medical University，Foshan 528114，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.22.037

登革熱是热带亚热带地区极为高发的传染病[1]，致病病原体登革病毒是黄病毒属的重要成员[2]，以伊蚊作为传播媒介[3]。目前，针对登革病毒仍无行之有效的特效药和疫苗[4]，因而，对登革热的早期诊断显得尤为重要。登革病毒非结构蛋白NS1在病毒的感染、复制及致病过程之中具有至关重要的作用。研究证实，NS1蛋白在4种病毒血清型间高度保守，其在血清中的检测常早于IgM抗体和RNA的产生，在登革热的早期诊断中具有重要作用[5]。针对登革病毒的检测常用的初步诊断方法为胶体金免疫层析法（以下简称为金标法），待检测结果确定为阳性后，采用荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）对送检样本进行确诊。虽然该诊断方法特异性强，然而整体诊断周期较长，不利于早期诊断。而针对NS1抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）具有诊断周期短、特异性较强的优点被广泛关注，针对该诊断方法，之前也有过许多相关的研究[6-8]。本实验拟使用更大的样本量，探究其与金标法及qPCR法在检测的灵敏度、特异性、阳性及阴性预测值、阳性及阴性似然比和约登指数等统计学指标上的差异性，为NS1-ELISA法在登革热的早诊早筛中的广泛应用提供理论基础，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 血清标本来自2012-2016年间在本院就诊的疑似登革热患者共362例，从静脉采血约6 mL后3 000 g离心15 min分离血清待测。

1.2 方法

1.2.1 胶体金免疫层析法 登革热快速检测试剂盒购于澳大利亚PanBio公司，操作过程按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 核酸提取及荧光定量聚合酶链式反应 核酸提取试剂盒购于北京Tiangen公司；登革热病毒通用性核酸检测试剂、登革病毒四型核酸荧光检测试剂盒购于上海之江生物科技有限公司。

1.2.3 登革病毒NS1抗原酶联免疫吸附试验 登革病毒NS1抗原ELISA试剂盒购于北京万泰生物药业股份有限公司。

1.3 诊断标准 本实验确诊为登革热的患者依据中华人民共和国卫生部发布的登革热诊断标准（WS216-2008版）进行[9]。

1.4 统计学处理 使用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计数资料采用率（%）表示，比较采用字2检验。列出统计表后进一步计算不同检测方法的特异性、敏感性、阳性及阴性预测值、阳性及阴性似然比和约登指数等统计学指标，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 依据卫生部发布的登革热诊断标准（WS216-2008），结合患者的病例资料，送检的共362例血清样本中，有205例（56.63%）被诊断为登革热患者，另外157例（43.37%）则为其他原因引起发热的非登革热患者。

2.2 三种检测方法的结果比较 分别使用三种不同的检测方法对所有362例送检血清样本进行登革热病毒NS1抗原的检测，见表1。三种检测方法中，金标法阳性检测率最高64.64%（234/362），qPCR法及ELISA法阳性检测率则分别为53.87%（195/362）和60.22%（218/362）。对三种检测方法的阳性检测率进行统计学分析，金标法和qPCR法相比差异有统计学意义（字2=8.261，P=0.004），而其他几种阳性检测率比较差异则无统计学意义（P>0.05）。

2.3 三种检测方法的检测效能比较 对三种统计方法检测登革病毒感染的灵敏度、特异性、阳性及阴性预测值、阳性及阴性似然比和约登指数进行统计学分析，见表2。统计结果显示，NS1-ELISA法检测登革病毒感染的灵敏度最高，金标法次之，qPCR法的灵敏度较其他两种方法相比略低；不同检测方法之间进行统计学分析时灵敏度之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。而特异性方面则与灵敏度的结果相反，qPCR法最高，NS1-ELISA和金标法的特异性有所降低；其中，qPCR法与金标法相比差异有统计学意义（字2=16.683，P<0.001），但qPCR法与NS1-ELISA法之间比较差异并无统计学意义

（字2=1.454，P=0.228）。从其他统计结果来看，NS1-ELISA法的阴性预测值最高，且ELISA法的阴性似然比也分别低于qPCR法及金标法。就约登指数而言，ELISA法要高于qPCR法及金标法，但ELISA法与qPCR法差别不大。见表3。

3 讨论

登革病毒所造成的登革热及登革出血热是严重威胁人类健康的传染病，其通过伊蚊传播的特点使得区域性爆发成为可能[10]。使用PCR的方法检测登革病毒RNA一直以来广泛应用，被认为是检测登革病毒感染的敏感而有效方案[11]。然而，在登革热的退热期，血清样本中病毒RNA的检测率往往不高[12]。此外，金标法也长期被用于登革病毒的诊断过程中，然而金标法检测结果灵敏度低、步骤繁琐以及对检测实验室要求较高等特点，具有一定的局限性[13]。所以，探索一种灵敏度、特异性较高且方便快捷的检测方法显得尤为重要。

本实验通过比较NS1-ELISA法与金标法及qPCR法在诊断登革病毒感染患者时灵敏度等统计学指标，旨在判断NS1-ELISA法在登革热诊断中的应用价值。通过比较分析发现，金标法虽然具有较高的检测阳性率，然而其灵敏度和特异性均明显低于qPCR法和NS1-ELISA法，因此，在诊断登革热的实际应用中出现误诊率及漏诊率均大于另外两种检测方法。根据实验结果，qPCR法具有较高特异性、阳性预测值和阳性似然比，说明qPCR法在排除非患病受检者的能力要明显高于其他两种方法，并且其检测结果为阳性的群体中确实为登革热患者的可能性更高，具有更强的诊断确实为登革热患病者的能力。NS1-ELISA法则具有更高的灵敏度和阴性预测值，说明该方法在检测时漏诊的可能性更低，同时其检测结果为阴性的群体中确实非患有登革热的可能性更大。约登指数，又称为正确指数，表明该检测方法在应用过程中发现真正患者和排除非患者的总能力。当约登指数越高时，表明该检测方法具有更高的真实性。从统计结果来看，NS1-ELISA法的约登指数略高于qPCR法且明显大于金标法，说明NS1-ELISA法的综合检验效能较其他两种方法显得更为突出。探究NS1-ELISA法用于早期诊断登革热的相关研究有很多。傅强等[14]研究结果证实，使用Ⅰ型和Ⅲ型登革病毒NS1蛋白制备多克隆抗体建立的检测NS1抗原的ELISA法在检测登革病毒时具有较高的灵敏度和特异性。从这个角度上来说，NS1-ELISA法在实验室登革热患者的诊断过程中具有一定的应用价值。本研究所得出的结论与之前的研究结果一致，优势在于本次研究具有更大的样本量，因此检测结果更具有一定的代表性和特异性，能够更好地说明研究结论。

此外，针对登革病毒NS1抗原所建立的诊断方法还有许许多多，其中最为常用的是通过NS1抗原与其他标志物如IgM/IgG、病毒核酸的检测等手段联合使用，能够大大提高登革病毒感染的诊断率[15]。总而言之，NS1-ELISA作为一种有效快捷的登革热早期诊断方法，在判断登革病毒的感染中具有非常重要的作用，具有廣泛的应用前景。

参考文献

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（收稿日期：2018-07-11） （本文编辑：周亚杰）