美拉德反应对芝麻多肽抗氧化活性的影响

钱森和王 洲魏 明薛正莲

(1. 安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000；2. 安徽工程大学微生物制药产业共性研究院，安徽 芜湖 241000)

芝麻多肽是芝麻蛋白经水解后得到的有生物活性的混合小肽，与蛋白质相比，这些小肽易于被人体吸收利用，且具有抗氧化、抗菌、降血压、调节免疫等生理活性，其中抗氧化作用是其重要的一种生理活性[1-2]。研究[3]表明，芝麻多肽具有清除机体自由基、抑制脂质过氧化以及提高抗氧化酶活性的能力，还能够降低小鼠血清和肝脏中丙二醛含量，提高肝脏中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性。

美拉德反应是羰基化合物与氨基化合物之间发生的一种复杂反应。美拉德反应对提高蛋白质功能性质以及食品品质方面具有重要作用，通过美拉德反应可以提高蛋白质的溶解性、乳化性、热稳定性以及胶体稳定性[4]；改变食品的色泽、风味以及营养价值[5]。研究[6]表明，美拉德反应产物中含有类黑精、还原酮以及挥发性杂环化合物，这些物质具有一定的抗氧化性能。

目前采用美拉德反应修饰生物活性肽的研究较多，例如：陈贵堂等[7]制备的灰树花多肽美拉德反应产物的还原力和DPPH自由基清除能力与等质量浓度的抗坏血酸相当；赵谋明等[8]以草鱼肽和木糖制备的美拉德反应产物的褐变程度更高、抗氧化活性更强，且随时间的延长抗氧化活性逐渐增强。然而，美拉德反应用于改善芝麻多肽抗氧化活性的研究还未见报道。本研究在制备芝麻多肽的基础上，筛选芝麻多肽美拉德反应的适宜还原性糖及其肽糖比，研究美拉德反应对芝麻多肽抗氧化活性的影响，以期提高芝麻多肽抗氧化活性；并进一步分析芝麻多肽美拉德反应过程中氨基酸组成及含量、褐变程度、接枝度以及紫外吸收光谱的变化，探讨芝麻多肽美拉德反应产物抗氧化的机理，为食品中天然抗氧化剂的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄糖、木糖、乳糖、十二烷基磺酸钠、β-巯基乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、过硫酸钾、乙酸钠、三氯化铁、双氧水：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

碱性水解酶、三氯乙酸、铁氰化钾、DPPH、ABTS、邻二氮菲等：分析纯，上海青析化工有限公司；

邻苯二甲醛、甲醇、乙腈：色谱纯，美国Agilent Technologies公司；

芝麻粕：安徽华安食品有限公司；

分析天平：FC-104型，上海精密科学仪器公司；

微型高速粉碎机：FW100型，天津泰斯特仪器有限公司；

恒温水浴锅：HH-6型，江苏金坛市亿通电子有限公司；

离心机：TGL-16型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

高校液相色谱仪： LC-20A型，日本岛津公司；

紫外—可见光分光光度计：TU-1800型，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芝麻多肽的制备 称取50 g芝麻粕，粉碎后过60目筛，用 0.1 mol/L NaOH溶液在40 ℃恒温水浴搅拌提取1 h，离心(8 000 r/min，10 min)后，取上清液(芝麻蛋白液)，在碱性蛋白酶(1.0×105U/g)与芝麻蛋白液(10%)的E/S为2%、pH 8.0、酶解温度40 ℃条件下酶解3 h，反应结束后沸水浴灭酶20 min，冷却后离心(8 000 r/min，10 min)，上清液冷冻干燥后于-20 ℃保存备用。

1.2.2 氨基酸含量测定 取1 mL多肽溶液，加入2 mL三氯乙酸沉淀蛋白后离心(12 000 r/min，10min)，经0.22 μm 膜过滤后采用HPLC法进行氨基酸含量的测定。色谱柱：Thermo Hypersil ODS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱温40 ℃；流动相，水相A：无水醋酸钠3.06 g，先溶于800 mL水，然后加三乙胺200 μL，四氢呋喃5 mL，ddH2O定容至1 L，醋酸调节pH至7.2，有机相B：无水醋酸钠3.06 g，ddH2O 定容至200 mL，醋酸调节pH至7.2，然后加入400 mL 甲醇和400 mL 乙腈；流速1 mL/min。采用OPA 试剂进行在线柱前衍生。

1.2.3 芝麻多肽美拉德反应还原糖种类及肽糖比的确定

用蒸馏水将芝麻多肽配置成质量浓度为5%的溶液，分别称取一定量的葡萄糖、乳糖和木糖，加到芝麻多肽溶液中，使肽糖的质量比分别为2∶1，1∶1，1∶2，1∶3。待完全溶解后用1 mol/L NaOH溶液调pH值至8.0，置于95 ℃水浴2 h，反应后迅速冷却，得到芝麻多肽美拉德反应产物，并置于-20 ℃保存备用。

1.2.4 芝麻多肽美拉德反应产物的制备 在选取适宜的还原糖和肽糖比的基础上制备芝麻多肽美拉德反应产物。反应条件同1.2.3，反应时间分别为1，2，3，4 h。

1.2.5 抗氧活性测定

(1) 还原力的测定：根据文献[9]方法略作修改，取多肽溶液及其美拉德反应产物各0.5 mL于试管中，加入0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲液(pH 6.6)2.5 mL和1.0%铁氰化钾溶液2.5 mL，混匀，于50 ℃保温20 min后置于冰浴中，并加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混合后于3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入蒸馏水2 mL和0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，振荡均匀后静置10 min，测定其在700 nm 处的吸光值(A700)。

(2) ABTS+自由基清除率测定：根据文献[10]方法略作修改，取7.4 mmol/L ABTS溶液2 mL与2.6 mmol/L过硫酸钾溶液2 mL，混合后室温避光放置16 h，用pH 4.5的20 mmol/L 乙酸钠缓冲溶液稀释混合液，使其在734 nm处的吸光值(A734)达到0.7±0.02，取2.0 mL稀释过的溶液与1 mL多肽液混合，静置6 min后测定A734值。

(1)

式中：

EA——ABTS+自由基清除率，%；

A0——加入去离子水的吸光值；

As——加入样品的吸光值。

(3) DPPH自由基清除率的测定：根据文献[11]方法略作修改，取1 mL样品与4 mL 0.02 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液混合，混匀后在室温避光放置30 min，混合液于3 000 r/min 离心5 min，取上清液，测定517 nm处的吸光值(A517)，用体积比1∶1的无水乙醇与水混合液作为参比。

(2)

式中：

ED——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白对照(DPPH+乙醇)的吸光值；

A1——加入样品时DPPH(样品+DPPH-无水乙醇)的吸光值；

A2——样品(样品+乙醇)的吸光值。

(4) 羟自由基清除率测定：根据文献[12]方法略作修改，取7.5 mmol/L FeSO4溶液0.2 mL，7.5 mmol/L邻二氮菲溶液0.2 mL，样品溶液0.4 mL，pH 7.4 PBS的溶液2.0 mL，蒸馏水0.8 mL 以及1.0% H2O20.4 mL于试管中，混匀后置于37 ℃ 恒温水浴60 min，测定其在536 nm处的吸光值。

(3)

式中：

EOH——羟自由基的清除率，%；

A0——以蒸馏水代替样品测得的吸光值；

A1——以蒸馏水分别代替样品和H2O2测得的吸光值；

A2——样品的吸光值。

1.2.6 褐变程度和接枝度的测定

(1) 褐变程度测定：根据文献[13]方法略作修改，以蒸馏水作为参比，在420 nm处测定芝麻多肽美拉德反应产物的吸光值作为褐变程度。

(2) 接枝度测定：根据文献[14]方法略作修改，取200 μL 质量浓度为2 mg/mL的芝麻多肽美拉德反应产物，加入邻苯二甲醛溶液4 mL，混匀后置于35 ℃条件下水浴2 min，测定其在340 nm的吸光值。空白对照组为4.0 mL邻苯二甲醛+200 μL蒸馏水。

(4)

式中：

DG——接枝度，%；

At——芝麻多肽美拉德反应产物在340 nm的吸光值；

A0——芝麻多肽溶液在相同反应条件下在340 nm的吸光值。

1.2.7 紫外光谱分析 用0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液将芝麻多肽美拉德反应产物稀释至质量浓度为1 mg/mL，采用紫外-可见光分光光度计全波长扫描。

1.3 数据处理、作图及统计分析

采用Excel 2010软件进行数据整理和做图，用SAS 9.1统计分析软件进行差异显著性分析，每个试验3次重复。

2 结果与分析

2.1 还原糖种类及肽糖比的确定

选取葡萄糖、乳糖和木糖3种代表性还原性糖与不同比例的芝麻多肽进行美拉德反应，研究糖的种类及肽糖比对美拉德反应产物还原力的影响，结果见图1。由图1可知，木糖与芝麻多肽发生美拉德反应后产物的还原力最高，而乳糖最低；可能是木糖为五碳糖单糖，其碳链短于葡萄糖，空间位阻小，更易于多肽发生美拉德反应；乳糖为还原性双糖，其分子量较还原性单糖的分子量大，从而导致反应速度较还原性单糖慢[15]。另外，随着肽糖比例的增加，反应产物的还原力逐渐增加，当肽糖质量比<1∶2时，其还原力增加不明显。因此，选取木糖与芝麻多肽1∶2的质量比进行后续的试验。

图1 还原糖种类及肽糖比例对芝麻多肽美拉德反应产物还原力的影响

图1 Effect of reducing sugar types and peptide sugar ratios on reducing force of mallard reaction products of sesame polypeptide

2.2 美拉德反应对芝麻多肽铁氰化钾还原力的影响

芝麻多肽及其美拉德反应产物的铁氰化钾还原力见图2。由图2可知，芝麻多肽美拉德反应产物的还原力随着反应时间的延长明显增大，在反应前2 h内，反应产物的还原力低于芝麻多肽；但在反应3～4 h时，还原力分别为0.83，0.92，显著高于芝麻多肽的还原力(P>0.05)。这与Jiang等[16]研究水溶性牛酪肽美拉德产物的还原力随反应时间延长而增加的结果相一致。

2.3 美拉德反应对芝麻多肽ABTS+自由基清除能力的影响

图3为芝麻多肽及其美拉德反应产物的ABTS+自由基清除率。由图3可知，美拉德反应能够显著提高芝麻多肽ABTS+自由基的清除能力，且反应产物的ABTS+自由基清除率随着反应时间的延长而逐渐增加，当反应时间为3，4 h 时，自由基清除率分别为43%，72%，显著高于芝麻多肽的清除率(P>0.05)。Zeng等[17]研究也表明，美拉德反应产物具有ABTS+自由基清除活性，且清除活性随反应时间的延长而增加。

Sp表示芝麻多肽；*表示与Sp比较，差异在0.05水平上显著图3 美拉德反应对芝麻多肽ABTS+自由基清除率的影响

图3 Effect of mallard reaction on the ABTS+free radical scavenging rate of sesame polypeptides

2.4 美拉德反应对芝麻多肽DPPH自由基清除能力的影响

图4为美拉德反应对芝麻多肽DPPH自由基清除率的影响。由图4可知，美拉德反应能够显著提高芝麻多肽DPPH自由基的清除率，当芝麻多肽美拉德反应1～4 h时，产物的DPPH自由基清除率显著高于芝麻多肽的(P>0.05)。

Sp表示芝麻多肽；*表示与Sp比较，差异在0.05水平上显著图4 美拉德反应对芝麻多肽DPPH自由基清除率的影响

图4 Effect of mallard reaction on the DPPH free radical scavenging rate of sesame polypeptides

2.5 美拉德反应对芝麻多肽羟自由基清除能力的影响

美拉德反应对芝麻多肽羟自由基清除率的影响见图5。由图5可知，在1～3 h内，芝麻多肽美拉德反应产物的羟自由基清除能力随着反应时间的延长而增强，但反应3，4 h自由基清除率差异不明显。另外，在反应2～4 h，产物的自由基清除率显著高于芝麻多肽的(P>0.05)。

Sp表示芝麻多肽；*表示与Sp比较，差异在0.05水平上显著图5 美拉德反应对芝麻多肽羟自由基清除率的影响

图5 Effect of mallard reaction on the hydroxyl free radical scavenging rate of sesame polypeptides

2.6 美拉德反应对芝麻多肽游离氨基酸含量的影响

图6为美拉德反应(4 h)对芝麻多肽游离氨基酸组成与含量变化。由图6可以看出，芝麻多肽美拉德反应后，体系中游离氨基酸含量发生了变化，含量明显增加的氨基酸有丙氨酸、缬氨酸；含量明显减少的氨基酸有赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸；其他氨基酸含量基本维持不变。另外，生成了天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸，可能是加热使得部分小肽发生降解[18]。其中生成的天冬氨酸和谷氨酸是酸性氨基酸，具有较强的抗氧化活性，另外，半胱氨酸的生成也能提高体系的抗氧化活性。

图6 美拉德反应对芝麻多肽氨基酸组成和含量的影响

图6 Effect of mallard reaction on the amino acid composition and contents of sesame polypeptides

2.7 美拉德反应的褐变程度及接枝度变化

美拉德反应褐变程度通常可以反映接枝反应的速率，褐变程度越强，表明接枝反应越快[19]。芝麻多肽美拉德反应褐变度与接枝度变化见图7、8。

图7 芝麻多肽美拉德反应褐变程度随时间的变化

图7 Changes in browning degree of sesame peptide mallard reaction as a function of reaction times

图8 芝麻多肽美拉德反应接枝度随时间的变化

图8 Changes in grafting degree of sesame peptide mallard reaction as a function of reaction times

由图7可知，芝麻多肽的褐变程度均随着反应时间的延长而逐渐增大，在反应4 h时，其420 nm处吸光值为1.45。另外，随着反应的进行产物颜色也逐渐加深，表明生成的类黑精也越来越多，其抗氧化活性越来越强[20]。

通过测定体系中自由氨基基团含量变化，可以反映出美拉德反应的进程[21]。从图8可以看出，芝麻多肽美拉德反应的接枝度也随时间延长而明显增大，在4 h时其接枝度为26.4%。由此可知，芝麻多肽美拉德反应的接枝度变化与褐变趋势基本相符，接枝度变化能够反映出褐变程度。

2.8 美拉德反应产物的紫外光谱

紫外光谱是美拉德反应产物结构表征与分析的重要手段，可以通过测定美拉德反应产物的紫外吸收峰来判断其结构的变化。由图9可以看出，芝麻多肽及其美拉德反应产物在210 nm左右具有较强的吸收峰，而这一吸收峰能够表征肽键的变化。随着反应时间的延长，美拉德反应产物吸收峰的最大值逐渐增大，与褐变程度和接枝度的变化相一致；且随着反应的进行，其光谱发生了红移现象，说明氨基酸基团周围微环境极性增强，疏水性减弱，使得多肽的结构变得更加松散[22]。另外，在260 nm处也有一吸收峰，这一吸收峰正是类黑精的特征，且随着反应时间的延长，其吸收峰的最大值也逐渐增加，表明随着反应的进行生成的类黑精逐渐增多[23]。

图9 芝麻多肽及其美拉德产物的紫外光谱扫描Figure 9 UV spectrum scanning of sesame polypeptide and its mallard products

3 结论

研究表明，芝麻多肽美拉德反应的适宜肽糖质量比为1∶2；美拉德反应能够提高芝麻多肽抗氧化活性，随着反应时间的延长，其还原力、ABTS+自由基清除能力、DPPH自由基清除能力以及羟自由基清除能力逐渐增强。美拉德反应改变了芝麻多肽中游离氨基酸组成和含量，生成的酸性氨基酸具有一定的抗氧化活性。芝麻多肽美拉德反应的褐变程度和接枝度随着反应时间的延长而增大，其产物的颜色逐渐加深，表明生成的产物逐渐增多。紫外光谱扫描分析表明，芝麻美拉德反应能够改变芝麻多肽的肽键，随着反应的进行，特征峰的吸光值逐渐增多，表明生成的类黑精物质逐渐增多。美拉德反应是一个复杂的过程，影响其产物抗氧化活性的因素较多，在后期的工作中将进一步深入研究。