基于星点设计——效应面法和正交设计的中药类风湿复方提取工艺研究

朱红梅， 王 姚， 曾奇璐， 杨 慧， 曹 鑫

(成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106)

0 引 言

中药类风湿复方由青风藤、延胡索、海桐皮、片姜黄4味药材组成.青风藤性平，味辛苦，入脾、肝，祛风湿，通经络，常用于风湿痹痛，关节肿胀，麻痹瘙痒，为君药；延胡索性温，味辛苦，具活血行气，止痛之功，为臣药；片姜黄性温味辛，具破血行气、通经止痛之力，为佐药；海桐皮性平，味辛苦，能祛风除湿，常用于风湿关节痛，腰腿酸痛，引药入经，为使药.四药合用，互相协同，具有祛风除湿，消炎止痛之效，可治疗风湿性关节炎、风湿痛等症[1].中药复方的提取工艺对复方药效有着重要的影响，目前的研究多以指标成分来确定复方提取工艺路线.星点设计是在二水平析因设计的基础上加上星点及中心点而成的实验次数较少、适宜进行非线性拟合的实验设计方法，已广泛应用于制剂工艺优化的各个环节[2-4].

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用材料包括：青风藤(批号，54191101)、片姜黄(批号，20170226)，购自北京同仁堂北京三和药业有限公司；延胡索(批号，20170220)，购自成都市荷花池中药材市场；海桐皮(批号，501002448)，购自北京同仁堂亳州饮片有限公司；青藤碱(批号，wkp16031603，HPLC>98%)、延胡索乙素(批号，141021，HPLC>98%)、吉马酮对照品(批号，150810，HPLC>98%)，购自四川省维克奇生物科技有限公司；95%乙醇、氨水、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三乙胺、无水乙醇、氨水、甲醇、磷酸，购自成都科龙化工试剂厂.HPLC用甲醇、乙腈为色谱纯，水为怡宝纯净水，其余试剂均为分析纯.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：BS-6KH电子天平(上海友声衡器有限公司)；BJ-150型高速多功能粉碎机(拜杰公司)；FA-2004型分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司生产)；P-230 II型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)；KQ-100E型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；101-1-S型电热鼓风干燥箱(成都雅源科技有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；DZTW型电子调温电热套(天津静海县工兴电器厂)；酒精计(武强同辉仪表厂).

2 方法与结果

2.1 指标成分的测定

2.1.1 青藤碱.

1)色谱条件与系统适用性实验.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇—磷酸盐缓冲液(0.005 mol/L磷酸氢二钠溶液，以0.005 mol/L磷酸二氢钠调节pH值至8.0，再以1%三乙胺调节pH值至9.0)(55∶45)为流动相，检测波长为262 nm，流速为1 mL/min[1].

2)对照品溶液的制备.取青藤碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.7184 mg的对照品溶液.精密量取上述对照品溶液，配制成浓度分别为0.3592 mg/mL、143.68 μg/mL、57.472 μg/mL、28.736 μg/mL的对照品溶液.

3)线性关系考察.分别吸取上述5种对照品溶液，按照“2.1.1"项下色谱条件进样，测定峰面积.以峰面积为纵坐标，青藤碱进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为，Y=1008.9X+2.6597(R2=0.9998).结果表明，青藤碱在0.2873～7.184 μg范围内，进样量与峰面积呈良好线性关系.

4)供试品溶液的制备.取提取液适量经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得.

2.1.2 延胡索乙素.

1)色谱条件与系统适用性实验.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺调节pH值至6.0)(65∶35)为流动相，检测波长为280 nm，流速为1 mL/min[1].

2)对照品溶液的制备.取延胡素乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5328 mg的对照品溶液.精密量取上述对照品溶液，配制成浓度分别为0.2664 mg/mL、106.56 μg/mL、42.624 μg/mL、21.312 μg/mL的对照品溶液.

3)线性关系考察.分别吸取上述5种对照品溶液，按照“2.1.2"项下色谱条件进样，测定峰面积.以峰面积为纵坐标，延胡索乙素进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为，Y=725.65X+15.741(R2=0.9999).结果表明，延胡索乙素在0.213～5.328 μg范围内，进样量与峰面积呈良好线性关系.

4)供试品溶液的制备.取提取液适量经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得.

2.1.3 吉马酮.

1)色谱条件与系统适用性实验.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈—水(60∶40)为流动相，检测波长为215 nm，流速为1 mL/min[1].

2)对照品溶液制备.取吉马酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含367.2 μg的对照品溶液.精密量取上述对照品溶液，配制成浓度分别为73.44 μg/mL、29.376 μg/mL、14.688 μg/mL、5.8275 μg/mL的对照品溶液.

3)线性关系考察.分别吸取上述5种对照品溶液，按照“2.1.3"项下色谱条件进样，测定峰面积.以峰面积为纵坐标，吉马酮进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为，Y=2881.9X+11.709(R2=1).结果表明，吉马酮在0.058～3.672 μg范围内，进样量与峰面积呈良好线性关系.

4)供试品溶液的制备.取提取液适量经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得.

2.1.4 固含物量测定.

精密量取4味药材的提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴锅上蒸干后，于干燥箱中105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量.

2.2 星点设计——效应面法

2.2.1 单因素实验.

1)乙醇浓度考察.研究表明，青风藤、延胡索、海桐皮主要成分均为生物碱[5-9]，且多采用乙醇为溶媒提取，故本研究同样选择乙醇溶液为溶媒.称取青风藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分别用8倍50%、60%、70%、80%、90%的乙醇加热回流提取3次，每次1.5 h，滤过，合并提取液.按照“2.1"项下的方法测定青藤碱、延胡索乙素的含量和固含物量.结果按青藤碱量—延胡索乙素量—固含物量=35∶35∶30进行综合评分计算，结果见图1.结果表明，综合评分分数先是随乙醇浓度增大而增加，后随之下降，当乙醇浓度为70%时，综合评分最高，故将70%乙醇定为提取溶媒.

2)乙醇用量考察.称取青风藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分别用4、6、8、10、12倍70%的乙醇加热回流提取3次，每次1.5 h，滤过，合并提取液.按照“2.1"项下的方法测定，结果见图1.结果表明，综合评分分数先是随乙醇用量增大而增加，后随之下降，当溶媒倍数为8倍时，提取液综合评分最高，故将提取的溶媒倍数定为8倍.

3)提取时间考察.称取青风藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分别用8倍50%的乙醇加热回流提取3次，每次分别0.5、1、1.5、2、2.5 h，滤过，合并提取液.按照“2.1"项下的方法测定，结果见图1.结果表明，当提取时间为1 h时，提取液综合评分最高，故选择提取时间为1 h.

4)提取次数考察.称取青风藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分别用8倍50%的乙醇加热回流提取1、2、3、4次，每次1 h，滤过，合并提取液.按照“2.1"项下的方法测定，结果见图1.结果表明，当提取次数为3时综合评分最高，故将提取次数定为3次.

图1乙醇浓度(A)、溶剂用量(B)、提取时间(C)和提取次数(D)对综合评分的影响

2.2.2 星点设计——效应面法优化提取工艺.

以乙醇浓度(A)(50%～90%)，溶媒倍数(B)(8～12倍)，提取时间(C)(30～90 min)为考察因素，以指标成分青藤碱、延胡索乙素的含量和固含物量的综合评分为评价指标.称取青风藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，按照星点设计——效应面法安排实验.实验因素水平表见表1，实验分组与结果见表2.

表1 实验因素水平表

1)模型拟合与预测评价.采用Design-Expert V8.0.6软件，以各综合评分值对自变量进行多元线性回归和二项式拟合[10]，线性方程为，

Y=96.09635-0.5033X1+0.91854X2+

10.0096X3

(R2=0.5319，P=0.0059)

二项次方程为：

Y=211.79685+0.4989X1-15.6395X2-

122.33112X3+(5.48008E-0.03)X1X2+

0.71771X1X3+11.00258X2X3-

(R2=0.7336，P=0.0460)

根据统计软件对各项系数进行的t检验结果，

表2 实验分组与结果

删除P>0.5的项后，再进行二项式方程拟合，达到简化模型目的，所得方程为，

Y=206.12217-0.5033X1-10.08404X2-

100.01622X3+11.00258X2X3

(R2=0.6346，P=0.0030)

从拟合方程相关系数可见，多元线性回归方程的相关系数较低，而多元二项式拟合方程相关系数较高，拟合效果较好.通过Design-Expert V8.0.6.软件预测分析，获得一组综合评分响应值最大的优化条件为：X1为50.00%，X2为8.00倍，X3为0.66 h.

2)验证实验.称取青风藤45 g、延胡索30 g、海桐皮45 g，用8倍50%的乙醇加热回流提取3次，每次40 min，滤过，合并提取液，平行3次.按照“2.1"项下的方法测定青藤碱、延胡索乙素的含量以及固含物量，并将预测值与实测值进行偏差计算，结果见表3.

表3 验证实验结果

注:偏差=(预测值-实测值)/预测值×100%

由表3可知，预测值与实测值间的偏差的平均值为11.31%，综合评分RSD为1.92%.结果表明，采用星点设计——效应面法选择的中药类风湿复方提取工艺重复性好，拟合结果合理、可靠稳定.

2.3 正交设计

2.3.1 单因素实验(药材粒径考察).

取片姜黄药材(直径约为1 cm)、片姜黄粗粉各50 g，以70%的乙醇渗漉，渗漉速度为3 mL/min，收集400 mL渗漉液.按照“2.1"项下的方法测定吉马酮量和固含物量，结果见表4.结果表明，当药材大小为粗粉时，吉马酮量和固含物量最高，故选择药材粗粉进行提取研究.

表4 片姜黄渗漉药材大小考察

2.3.2 正交设计优化提取工艺.

以乙醇浓度(A)，渗漉速度(B)，渗漉液的量(C)为考察因素，以指标成分吉马酮量和固含物量的综合评分为评价指标.分别称取片姜黄药材粗粉各50 g，按照L9(34)正交表安排实验.因素水平表见表5，正交试验设计与结果见表6，方差分析见表7.

表5 正交试验因素水平表

表6 正交试验设计与结果

表7 方差分析

由表6、7结果可知，各因素对提取的影响程度为C>A>B，且各因素对提取效果的影响均无显著性影响.因此，根据K值并结合工业大生产实际，确定最佳工艺为A2B3C3，即60%乙醇渗漉提取，渗漉速度3 mL/min，收集8倍量滤液.

2.3.3 验证实验.

取片姜黄药材粗粉50 g，平行3组，按照正交试验优选的最佳提取工艺条件进行验证实验，结果见8.

表8 片姜黄提取工艺验证实验结果

由表8可知，吉马酮含量RSD为2.29%，固含物量RSD为1.88%，表明所选工艺稳定可行.

3 讨 论

中药类风湿复方由青风藤、延胡索、海桐皮、片姜黄4味药材组成，临床上多将该4味药材用酒浸泡后成药酒涂抹于病变处.相关研究表明，青风藤、延胡索、海桐皮主要成分均为生物碱，且多采用乙醇为溶媒回流提取.本研究结合药材有效成分提取工艺并考虑实际生产成本等因素，将青风藤、延胡索和海桐皮一起提取，采用单因素实验和星点设计——响应面法结合的方式对药材的提取工艺进行研究，对片姜黄采用乙醇渗漉提取，并采用单因素实验和正交试验相结合的方式对药材的提取工艺参数进行研究.

星点设计——效应面优化青风藤、延胡索、海桐皮提取工艺，预测值与实测值间的偏差平均值为11.31%，略大，可能的原因为验证实验与工艺优化工艺时间间隔较长.验证实验综合评分RSD为1.92%，较稳定，表明采用星点设计——效应面法选择的中药类风湿复方提取工艺重复性好，拟合结果合理，可靠稳定.正交设计方差分析结果显示，因素无显著性影响(P>0.05)，本研究则根据K值并结合生产需要确定提取工艺，并进行验证实验，表明正交设计所选工艺稳定可行.本研究所确定的中药类风湿复方提取工艺稳定可行.