α1,3-D-半乳糖基转移酶基因425C→T突变导致B3亚型分析

崔文燕，王钰菁，邹 纬，王学锋，蔡晓红

1)郑州大学第二附属医院输血科 郑州 450014 2)上海交通大学医学院附属瑞金医院输血科 上海 200025

ABO血型亚型是红细胞膜上ABO血型抗原决定簇数量或性质发生改变所致，具有明确的血清学特点，并且具有遗传基础。ABO血型亚型产生的主要原因是ABO基因第6或第7外显子发生了点突变或者ABO基因内发生了交换或重组，降低或改变了糖基转移酶的活性，导致抗原弱表达或变异，致使血型血清学表现为红细胞抗原凝集减弱，混合视野凝集，血清中出现不规则抗A、抗B抗体或抗A、抗B抗体凝集减弱，从而给血型鉴定工作带来了困扰[1-4]。作者通过手术备血发现一例B3亚型，ABO血型鉴定正反定型不一致，对其家系采集标本并进行DNA突变位点研究，进一步探讨B3亚型的分子机制及遗传特性。

1 对象与方法

1.1研究对象先证者为瑞金医院患者，男，92岁，汉族，既往无特殊病史，无输血献血史，家族中无遗传病史。因胆囊结石行手术切除，ABO血型鉴定正反定型不一致，并用试管法进行复检。采集其儿子、女儿血标本进行分析，家系图见图1。所有标本均为EDTA 抗凝外周静脉血5 mL。

□：男性；○：女性； ■：B3亚型者；→：先证者图1 家系图谱

1.2试剂与仪器单克隆抗A、抗B试剂(批号：20161015)，ABO反定型标准红细胞(批号:20175335)，不规则抗体筛检号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ细胞(批号：20170737)，抗H试剂(批号：20160707)均由上海血液生物医药有限责任公司提供；全自动血型分析仪(强生公司，型号：AutoVueInnova)；血液基因组DNA抽提试剂盒(德国QIGEN公司，批号：148039042)；TaKaRa LA Tap酶(日本TaKaRa公司，批号：RR02MA)；PCR仪(美国ABI公司，货号：4483636)；DNA测序仪(美国ABI公司，型号：PRISM377)；离心机 (日本久保田公司，型号：KA-2200)。

1.3血清学检测将EDTA抗凝外周全血离心取红细胞做ABO血型正定型，血浆做反定型，并做自身对照。红细胞H抗原检测中取B细胞和O细胞为对照细胞，抗体筛查细胞检测血清中有无不规则抗体。

1.4α1,3-D-半乳糖基转移酶活性检测①指示红细胞的制备：挑选3人份O型献血者红细胞，用生理盐水洗3遍，取压积红细胞10 μL，加入100 μL反应液[0.05 mol/L咪唑缓冲液(pH 6.5)10 μL，25 mmol/L氯化镁10 μL，0.15 mol/L氯化钠10 μL，0.5 mmol/L UDP-Gal 10 μL，体积分数0.5% BSA 10 μL，待检血浆50 μL]中，总体积110 μL，37 ℃ 水浴4 h后用生理盐水洗3遍，再配制成体积分数5%红细胞悬液待用。②标准血清的稀释：将单克隆抗B抗体用生理盐水按体积比11、12、14、18、116、132、164、1128进行倍比稀释后待用。③酶活性检测：取50 μL的指示红细胞悬液与50 μL不同稀释度的单克隆抗B混和后置室温反应20 min，1 000 r/min离心30 s，通过肉眼和显微镜观察凝集强度，血浆酶活性强度以发生凝集的抗体最高滴度来表示，并选取B型和O型各3人份献血者血浆做阳性和阴性对照。

1.5基因测序①DNA提取和PCR扩增。取200 μL白膜层血样，用QIAamp试剂盒提取全基因组DNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。每个标本的反应液为50 μL：TaKaRa LA Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，10×LA Taq PCR反应缓冲液Ⅱ5 μL，dNTP 混合液(2.5 mmol/L)8 μL，第6、7外显子上下游引物各2 μL，DNA 4 μL，ddH2O 28.5 μL。使用的引物根据ABO基因序列(GenBank序列号：N_000009)参考文献[5]设计。反应程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取3 μL PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳，剩余47 μL送上海生工生物工程技术服务有限公司进行检测，并用Chromos软件比对，分析测序结果。②基因测序及克隆。采用DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化PCR扩增产物，正反双向测序，在ABI PRISM377测序仪上对第6和第7外显子及其侧翼序列进行测序。第7外显子的PCR产物克隆到pMD18-T载体(TaKaRa公司产品)，PCR插入片段在ABI PRISM377测序仪上进行序列分析。

2 结果

2.1家系成员ABO血型血清学鉴定结果先证者术前备血时自动血型检测系统发现ABO血型正定型抗B有混合视野凝集，反定型正常，自身对照阴性，见图2，不规则抗体筛查阴性。立即进行试管法复验，试管法发现正定型抗B显示有混合视野凝集，反定型正常，鉴定为B3亚型。先证者儿子、女儿血型血清学检测结果见表1。

1：抗A抗体；2：抗B抗体；3：抗D抗体；4：自身对照；5：A1细胞；6：B细胞

图2 先证者自动血型检测系统结果表1 B3亚型家系成员血型血清学检测结果

2.2α1,3-D-半乳糖基转移酶活性测定结果先证者及其儿子的血浆α1,3-D-半乳糖基转移酶活性均<1；阳性对照为1∶64，阴性对照为<1。

2.3DNA测序及克隆分析结果先证者第6外显子测序显示：261缺失G杂合，297G→A。第7外显子测序显示： 425C→T，526G→C，657T→C，681A→G，703A→G，771T→C，796C→A，803C→G，930A→G。等位基因的命名遵循ISBT命名法。患者ABO基因第7外显子存在c.425C→T杂合突变，克隆后的PCR产物测序结果显示：c.425C→T突变位于患者的B等位基因上，即先证者ABO基因型为B305/O102(图3)。425C→T突变导致α1,3-D-半乳糖基转移酶的第142位氨基酸由甲硫氨酸转变为苏氨酸。先证者之子与先证者碱基突变位点一致，也存在425C→T突变，基因型鉴定为B305/O102；先证者之女为O102。

方框内的碱基为425突变位点图3 先证者B3等位基因测序结果

3 讨论

ABO血型基因定位于9q34.1-34.2[6]，基因多态性多位于第6和第7外显子，错位突变引起的氨基酸替换是导致ABO抗原表达减弱的主要原因[1]。目前对亚型基因判定最直接的方法是对ABO基因的第6和第7外显子进行测序[7-8]。本研究通过对先证者家系基因测序发现，先证者血浆中α1,3-D-半乳糖基转移酶活性很弱，存在c.425C→T位点突变，其儿子遗传了该突变，最终确定为B305/O102亚型，符合孟德尔遗传规律。这说明B3亚型除了具有明确的血清学特点外，还具有遗传特性。与B101序列相比，425位点这一突变导致多肽链第142位甲硫氨酸被苏氨酸替换。甲硫氨酸是含硫的两性氨基酸，在代谢中起着重要作用，可以反应生成S-腺苷-I-甲硫氨酸，在反应中是甲基供体的服务器。苏氨酸是含有羟基的亲水分子氨基酸，替换甲硫氨酸可造成α1,3-D-半乳糖基转移酶活性部分丧失，致使D-半乳糖通过糖基化作用与前体H物质的连接发生部分失活，使得B抗原合成量减少，出现了混合视野。先证者红细胞与抗H抗体作用后增强也佐证了这一点。

ABO亚型具有相对特殊的血清学特征，混合视野凝集是B3亚型红细胞的明显特征，显微镜下观察，B3亚型红细胞与抗B或抗AB血清孵育后出现一些被绝大部分游离的非凝集红细胞包围的数个红细胞形成的凝集块[9]。若将凝集细胞去除，剩余的游离细胞再与抗B血清反应，仍然出现混合视野凝集。对先证者进行血清学检测发现，红细胞与抗B抗体作用出现混合视野凝集、反定型一致，不规则抗体筛查阴性，鉴定为B3亚型；采集其儿子、女儿血标本进行检测，儿子与父亲血型一致，正定型抗B出现混合视野凝集，反定型B型，鉴定为B3亚型，女儿为O型。

B基因编码α1,3-D-半乳糖基转移酶，其功能是转移一个D-半乳糖到H物质的岩藻糖化半乳糖残基上，形成B抗原。ABO基因位点突变可导致相应糖基转移酶的异常，从而出现ABO亚型。本文通过α1,3-D-半乳糖基转移酶活性测定显示先证者血浆中α1,3-D-半乳糖基转移酶活性<1，提示先证者血浆中α1,3-D-半乳糖基转移酶活性很弱，B3亚型等位基因编码的糖基转移酶运转能力差，这可能与亚型血型本身红细胞上的B抗原量少、糖基转移酶活性低有关。

目前发现[10]，425碱基突变C→T存在于2种等位基因上：在A等位基因上突变导致Ael表型，在B等位基因上突变导致B3表型。许先国等[11]报道的2例B305等位基因与A1(A101或A102)等位基因组合遗传表现为B3变异型，出现混合外观凝集现象；李归冀等[12]报道B305与O101等位基因组合在一起，血清学表现为比正常B抗原凝集稍弱，未出现B3血型特异性的混合外观表现。而在本例样本中发现，B305与O102组合在一起，表现出混合视野凝集。这表明B305与不同等位基因组合，血清学表现会有所不同，这还需要进一步的群体调查或者体外表达去验证。

ABO 系统是人类发现最早的血型系统，也是最常用最重要的血型系统，在临床输血、新生儿溶血病和器官移植中具有很重要的临床意义[13]，但是在ABO血型系统中存在一部分亚型，导致血型正反定型不符，对鉴定血型造成了一定的干扰[14]。鉴于ABO血型抗原表达的复杂性，采用血型血清学检测与基因分型相结合的方法，对血型的正确定型以及临床安全输血具有重要意义。