谷淑波,宋雪皎,王树芸,高居荣
(农业部作物生理生态与耕作重点实验室 山东农业大学农学院,山东 泰安 271018)
氮素是影响小麦(Triticumaestivum)产量的重要矿质元素,不仅是蛋白质、核酸、磷脂的主要成分,还是某些植物激素、维生素和叶绿素的成分,氮的含量会直接影响细胞的分裂和生长[1]. 为了提高小麦的产量,人们在小麦种植过程中大量施入氮肥. 由于氮肥活性强,施入土壤经过转化后,除被作物吸收和土壤固持外,相当部分氮通过氨挥发、硝化、反硝化、径流和淋溶等途径损失,氮素利用率明显偏低[2-4],并造成地下水体污染[5].
适量施入氮肥是小麦获得高产的必要途径,不同的施肥时期、施肥量和施肥方法均会影响小麦的品质和产量[6-7],因此,在尽可能地提高小麦优质高产的同时,还必须促进氮素向籽粒中的运转,提高氮素在籽粒中的分配比例. 定量化地研究小麦在整个生育期内吸收运转氮素,从整体水平上把握植物体的氮素营养动态,稳定性同位素15N示踪技术被认为是一种有效的手段[8-9]. 由于15N是一种稳定性同位素,无放射性,因而存在于自然界而无辐射污染. 已有文献通过测定天然氮同位素研究原油氮沉积环境[10-11]、城市湖泊沉积物[12-13]、气候变化[14]、小麦产地溯源[15]、土壤N2O溯源[16]、农业面源污染[17]等领域.
元素分析仪-同位素比质谱仪(EA-IRMS)联用技术具有样品前处理简单、用量少、仪器操作简便、测量精度高和分析速度快等优点,因此该技术得到了迅速发展. 之前已有许多文献报导了未经标定样品中稳定氮同位素比值的分析和测定方法[18-19],但检测15N标记后的小麦植株不同器官δ15N值的具体测试方法还未见报导. 为了有效确定小麦植株对氮肥的吸收效率及在小麦各器官中的分配比例,本文建立了利用元素分析仪-同位素比质谱仪联用技术对大田栽培条件下15N标记氮肥施入后采集的不同器官材料δ15N值的测试方法,优选了仪器的最佳测试条件,完成了测定方法精密度和准确度的测试,确定了小麦样品的最佳进样量,以期为研究小麦生长发育过程中氮素的运转吸收利用提供有效的技术支持.
稳定同位素比质谱仪(Isoprime100,英国 Isoprime公司生产) ;元素分析仪(vario MICRO cube,德国Elementar公司生产);质谱仪软件是Ionvantage,元素分析仪部分配有120位固体自动进样器;百万分之一天平(ME5型,德国Sartorius公司,精度为0.01 mg);混合球磨仪(MM400,德国Retsch公司);锡囊6 mm×4 mm;硫酸铵标准物质(IAEA-N-2,δ15NPDB=20.343‰,国际原子能机构);小麦粉标准物质 OAS/Isotope(δ15N=+2.85);铬酸铅、银丝、氧化铜、高纯还原铜,均购自德国Elementar公司;高纯He气、高纯O2气和高纯N2气的质量分数均为99.999%(山东省临沂宏达特气厂);15N-尿素( 46.6% N,10.30 %丰度,上海化工研究院生产).
1.2.1 测试过程
将粉碎过筛后的固体样品包入锡囊称重,再放入元素分析仪上的样品盘内. 待仪器稳定启动分析后,自动进样器会将样品送入高温950 ℃的燃烧管内. 在燃烧管内暂时的富氧条件下样品和锡囊均发生融化、燃烧,燃烧产物随流速恒定的载气He气通过氧化催化剂,氧化产物通过随后的还原反应管. 还原管中的线状铜将氮氧化物(NO、N2O和N2O2)还原成N2,将SO3还原成SO2,并且将多余的氧气吸收. 挥发性的卤素化合物则被位于还原管上方的银丝层吸收. 经过还原管后生成的CO2、N2和SO2进入解析附柱. 通过对解析附柱的温度控制,先将N2气释放出来,然后从元素分析仪尾部进入质谱仪. 样品中的氮同位素比值经过已知组成的参考气的脉冲峰校准后最终测得δ15N值[20].δ15N值的表达式为:
(1)
式中:R样品、R标准分别为样品、国际标准物质中15N与14N的丰度比(15N/14N).
1.2.2 测试条件
稳定性同位素质谱仪参考气压力设为0.1 MPa,He气流速设为10 mL/min;元素分析仪载气He气流速设为200 mL/min,压力为0.13 MPa;设置加氧流速为40 mL/min,加氧时间为90 s;热导检测器(TCD)温度为60 ℃;解吸柱温度为210 ℃.
试验材料为15N微区试验条件下的冬小麦植株样品,标记方法参考文献[21],于小麦出苗后10 d,在某一微区内用土钻取土至标记深度,将10 mL 溶解了15N-尿素的去离子水溶液随PVC管注射至所需土层,再用30 mL 去离子水分3次冲洗容器及PVC管,然后将之前所取土壤按原有层次回填,轻微压实. 各个微区内的肥料、灌水等田间管理均与大田试验一致. 待小麦成熟期,将植株沿地表剪断、取样,并将植株样品分为籽粒、颖壳+穗轴、叶片和茎鞘4部分,70 ℃烘干至恒量,用球磨仪粉碎样品,过150 μm 筛,即可用于称量、上机测定.
1.4.1 调试仪器
仪器只有当达到一定条件才可以正常工作,因此每次开机预热后,要首先检查稳定同位素比质谱仪的真空值. 当High Vac 小于2e-11MPa,Low Vac 小于3e-6MPa时,说明仪器达到理想水平,然后再依次进行仪器的检漏测试、N2峰中心扫描、系统背景检查、N2参考气稳定性和线性测试.
1.4.2 样品分析顺序
为保证测试样品的准确,在分析前准备好标准样品(STD1)一个,另取一个性质稳定的具有代表性的实际样品(STD2),把这两个样品作为测试过程中质量监控的标准物质. 测试时先做空白3~6个,确保整个测试系统背景值达到理想的程度,再测试标准样品3个,确保仪器工作状态稳定. 每连续测试10个样品后插入STD1和STD2各1个,以便质量控制,保证系统的长期稳定性.
1.4.3 高纯N2参考气δ值的校正
样品的δ值是根据参考气已知值推导出来的,因此必须首先以硫酸铵作为参考标准,对高纯N2参考气进行校正,重复测量3~5个标准样品,确保样品测量的精度(标准偏差)小于0.15‰,根据分析结果的平均值反算出高纯参考气的真实δ15N值,在数据处理方法中将真实的参考气δ15N值输入,之后样品计算时将自动按照此δ15N值进行计算.
2.1.1 仪器系统背景优化
仪器运行过程中的系统背景对测定结果的准确度影响较大,如果系统有漏气故障或是参考气的进样针阀不能完全关闭,使少量参考气持续进入到质谱仪中,都会造成系统背景升高. 因此在质谱参考气压力为0.1 MPa,He气流速为10 mL/min条件下,首先对系统进行背景扫描,观察各个质量数(mass 18,28,32,40,44)的信号强度,结果如图1所示. 由图1可见,各个质量数的信号强度都很低,说明仪器运行过程中系统本底很低,系统背景正常.
图1 EA-IRMS系统的背景扫描结果Fig. 1 Background scanning result of EA-IRMS system
2.1.2 峰中心扫描
时间和温度等环境条件变化,有可能造成每个质量数对应的磁场或加速电压发生一定的偏移. 为了保证质谱仪离子束测量处于最优化的状态,必须在测试样品前进行峰中心扫描. 经峰中心扫描测试,优化加速电压,最终确定优化后的加速电压为4 100 V.
2.1.3 仪器稳定性优化
仪器的稳定性直接影响仪器测量的精度,EA-IRMS系统的稳定性不仅受离子源极片之间的相对位置、离子源与分析管道间的相对位置、永久磁铁和灯丝位置的影响,同时供电环境也会影响仪器的稳定性[22],载气纯度、仪器灵敏度等也都影响测试数据的稳定性. 在进行样品测定前,要保证空白样品产生的峰面积已经稳定,但如果峰面积不稳定则会对测试结果产生很大影响. 因此连续通入10组N2标准气进行空白测定,测定结果如图2所示.
图2 EA-IRMS系统的稳定性测试结果Fig. 2 Stability result of EA-IRMS system
由图2可以看出,10组空白样品产生的峰基本一致,计算得出标准气N2的同位素比值29/28的平均值为0.007 414 8,标准偏差为0.03‰,满足仪器要求标准气N2的同位素比值29/28的标准偏差低于0.06‰的条件,表明仪器稳定性可靠. 这同王政等[23]测得的0.017‰略有不同,可能是由于质谱仪的生产厂家不同,仪器的离子源和电气参数不同造成的.
仪器的线性也影响测定结果的准确度,而离子源应该显示其线性特征,即测量的同位素比值不会随信号强弱的不同而改变,这样才能确保对不同样品进行分析时获得可信的同位素结果. 本试验在进样前依次改变参考气进样器上N2的压力,每个参考气峰都会产生不同的信号强度. 通过计算,主同位素信号 Major 在 1e-9至 1e-8A(相当于1.0~10.0 V )之间,测得的总体线性为0.009 ‰/nA,达到了仪器要求的线性指标小于0.02 ‰/nA 的测定要求. 而王政等[23]的工作中,当离子流强度范围为0.5~7.5 V时,总体线性R为0.056‰,其主要原因是仪器性能不同,拉出电压不同,致使线性结果不同,但测得的线性结果都符合仪器的测试要求.
测量数据的准确性与样品进样量有直接的关系,称量样品过少则不具代表性,数据不准确;样品过多,则会增加测试过程中消耗的各种试剂,如高纯还原铜、银丝、高纯氦气等,提高测试成本. 因此称取小麦粉标准物质1、2、3、4、5 mg,分别进行6次重复测定,其δ15N数据结果如表1所列.
表1 不同进样量的δ15N值测定结果Table 1 δ15N determination results of different sample weights
从表1可以看出,进样量为4、5 mg时,测得样品的平均值与标准值+2.85‰相近. 但进样量为4 mg时标准偏差最佳,因此确定经15N标记的冬小麦植株成熟期收获的籽粒、茎鞘、叶片、颖壳4部分最佳进样量为4 mg,测得的小麦δ15N值的标准偏差均小于5%,与前人研究中高梁样品称取3~5 mg相一致[18].
分别称取IAEA-N-2、OAS和小麦籽粒、茎鞘、叶片、颖壳约4 mg进行测定. 经过6次重复测定,结果如表2所列. IAEA-N-2、OAS和小麦籽粒、茎鞘、叶片、颖壳的测定平均值分别为20.34‰、2.82‰、1439.56‰、1149.43‰、1335.45‰、1321.60‰,稳定氮同位素的标准偏差均小于5%,测量精度良好. 其中硫酸铵标准物质( IAEA-N-2)和小麦粉标准物质OAS/Isotope与标准物质证书的参考值相近,说明该测试方法满足小麦各营养器官的准确度测定.
表2 EA-IRMS系统测定标准样品和小麦样品δ15N的准确度Table 2 Accuracy of determination of δ15N values in standard materials and wheat samples by EA-IRMS system
本文选取小麦苗后10 d用15N-尿素标记处理和未标记条件下的成熟期样品进行测定,测定结果如表3所列.
表3 苗后15N标记小麦成熟期各器官及天然小麦样品的δ15N值Table 3 δ15N values of different wheat organs at maturity of labeled wheat after seedling and natural wheat /‰
从表3可以看出,用15N-尿素标记不同处理的样品δ15N值范围为2721‰~787‰,标准偏差在0.4%~11.9%之间,未经标记的小麦样品δ15N值范围为6‰~13‰,标准偏差在0.1%~0.4%之间,测量结果准确度较高.15N-尿素标记不同处理间δ15N值差异较大,同一处理间δ15N值表现为叶片和籽粒较高,茎鞘和颖壳较低. 这说明元素分析仪-同位素比质谱仪联用技术对于测定15N标记小麦植株各器官的δ15N值是可靠的,可以满足小麦栽培领域应用稳定性同位素15N进行氮素利用及分配方面的研究.
本文通过对仪器的调试和15N标记的小麦样品δ15N值测试试验,初步建立了测定15N标记小麦植株各器官中稳定氮同位素的分析方法,测量结果准确. 因此,元素分析仪-同位素比质谱仪联用技术可以用于测定15N标记小麦植株各器官15N值,可应用于小麦栽培领域稳定性同位素15N分析氮素在小麦体内运转及利用效率方面的研究,EA-IRMS是深入研究小麦生长发育的重要仪器.