脊髓损伤后虫草素增强突触分化诱导基因1的表达

孙丹华 陈旭东 徐纪伟

(漯河医学高等专科学校基础医学部, 漯河 462002)

脊髓损伤后神经功能难以恢复,这是因为神经细胞再生修复能力较弱以及损伤区域出现大量炎症介质、过氧化物、钙离子及神经生长抑制因子[1],神经细胞受到毒性损伤,因此改善脊髓内微环境,减少炎症因子,才能激活内源性再生系统,有利于神经功能恢复[2]。蛹虫草是我国传统珍贵中药材,它性甘、温平、无毒,具有抗炎、抗自由基、免疫调节和抗肿瘤等药理作用,它的有效活性成分是虫草素即3′-脱氧腺苷[3-4]。本研究采取虫草素治疗脊髓半横切损伤,用免疫组织化学方法和免疫印迹观察突触分化诱导基因1(synapse differentiation induced gene 1, SynDIG1)表达,用BBB评估体系和斜板试验评价肢体运动情况,探讨神经损伤修复的内在机制。

1 材料和方法

1.1 材料

选取200～220g SD雌性大鼠240只(中原正大实验动物中心,合格证： SCXK豫2010-0002)。

虫草素购自于美国Sigma公司;小鼠抗大鼠SynDIG1抗体购自密理博公司;FITC标记山羊抗小鼠IgG、生物素化山羊抗小鼠IgG、ABC试剂均购自中杉生物公司;Leica CM1850恒冷箱冰冻切片机购自Leica仪器有限公司;荧光显微镜购自中国奥卡光学仪器有限公司。

1.2 动物模型

动物随机分成对照组、损伤组、低剂量和高剂量治疗组。脊髓损伤模型,用戊巴妥钠麻醉大鼠,将其四肢固定于实验台上,剪除皮毛消毒,切开后背正中皮肤,分离皮下组织和肌肉,咬除第9、10胸椎棘突及椎板,露出脊髓组织,快速切断一侧脊髓,缝合伤口,注射抗生素。

低、高剂量治疗组分别给予腹腔注射虫草素5mg/kg、12.5mg/kg,1周后停药,损伤组用0.9%NaCl代替虫草素,对照组仅给予抗感染治疗。

1.3 取材和切片

术后14、21、28、35d,每组每时点选5只动物。用戊巴妥钠麻醉大鼠,打开胸腔露出心,将针头插入左心室至升主动脉,切开右心房,注入0.9%NaCl 250ml,待流出液体清亮注入4%多聚甲醛300ml,咬除棘突和椎板,暴露脊髓组织,取损伤区脊髓组织,行OCT包埋切片。

1.4 免疫荧光染色

切片滴加SynDIG1抗体,4℃过夜,PBS洗3次,每次5min,再滴加FITC标记山羊抗小鼠IgG,4℃孵育12h,PBS洗3次,每次5min,甘油封片,在荧光显微镜下观察。阴性对照不加一抗,只加二抗。镜下观察到绿色神经细胞即为SynDIG1阳性细胞,每只动物取5张切片计数阳性细胞总数,取每个时点平均值。

1.5 行为学评价方法

1.5.1 斜板试验 将各组大鼠置于一块平坦但不光滑的斜板上,斜板由零度缓慢上升,每次升高5°,至大鼠停留原有位置而不跌落5s时读取斜板度数,每只大鼠重复3次取平均值。

1.5.2 BBB运动评分 将动物放入带条纹的地板,轻敲盆壁使其爬行。观察臀、膝、踝的运动,观察脚掌负重站立和躯干协调运动情况,观察后脚爪伸展着地和尾巴的平衡情况。

1.6 免疫印迹

术后5个时间点每组取5只动物取材,取损伤区脊髓组织并研磨,冰上静置1h,低温高速离心15min,吸取上清待用,用SDS-PAGE不连续缓冲系统电泳,将PVDF膜放入TBST(含50g/L脱脂奶粉)封闭2h,TBS洗3次,每次5min;滴加SynDIG1抗体(1∶500),4℃过夜,TBS洗3次,每次5min,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(1∶500),放置2h,TBS洗3次,每5min,加ABC试剂,DAB显色,测目的条带与β-actin条带的吸光度值比值。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 虫草素治疗明显增加损伤脊髓的SynDIG1表达

术后第14天,高、低剂量治疗组和损伤组脊髓内均有SynDIG1阳性神经细胞,在28d达到高峰,之后呈高水平表达,且SynDIG1阳性神经细胞数量高剂量治疗组明显高于低剂量治疗组,低剂量治疗组明显高于损伤组,而对照组则无SynDIG1阳性神经细胞(图1,表1)。

图1 脊髓损伤后28d各组SynDIG1表达,免疫荧光染色,×200,标尺=50μm

表1 脊髓损伤后各时间点SynDIG1阳性神经元数量

*P<0.05vsinjury group;△P<0.05vslow dose treatment group;#P<0.05vshigh dose treatment group

2.2 虫草素增加损伤脊髓的SynDIG1的含量

术后第14天,高、低剂量治疗组和损伤组的脊髓内出现SynDIG1表达,且呈现逐渐升高趋势,一直到损伤后第28天达到峰值,之后一直维持在较高水平;并且SynDIG1表达水平高剂量治疗组明显高于低剂量治疗组,低剂量治疗组明显高于损伤组,对照组则未见SynDIG1表达(图2)。

2.3 虫草素改善脊髓损伤大鼠的BBB评分

所有动物术前评分为21分,在术后14d对照组评分达到20分,功能基本恢复正常。高、低剂量治疗组和损伤组BBB评分呈现逐渐升高趋势,且术后各时间点高剂量治疗组BBB运动功能评分明显高于低剂量治疗组和损伤组,低剂量治疗组BBB运动功能评分明显高于损伤组(表2)。

2.4 虫草素提高脊髓损伤大鼠斜板试验评分

术前动物斜板试验角度达70°～75°,术后斜板试验角度至20°,表明模型制作成功。高、低剂量治疗组和损伤组斜板试验角度呈现逐渐增大趋势,且术后各时间点高剂量治疗组斜板试验角度明显大于低剂量治疗组和损伤组,低剂量治疗组斜板试验角度明显大于损伤组(表3)。

图2 免疫印迹检测各组脊髓SynDIG1的表达

表2 术后各组BBB评分比较 分)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsinjury group;#P<0.05vslow dose treatment group

表3 术后各组斜板试验比较

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsinjury group;#P< 0.05vslow dose treatment group

3 讨论

脊髓损伤后由于机械性破坏组织结构导致神经细胞损伤和凋亡,同时由于大量的炎症因子和自由基释放、钙离子内流失衡、调亡基因大量表达,这些因素将会引起细胞周期停滞,损伤DNA,引发细胞凋亡,特别是炎症因子会促使神经突触囊泡内的谷氨酸大量释放,使神经细胞受到谷氨酸兴奋性毒性损伤,进一步加重神经损伤[9]。

中枢神经系统中腺苷具有调节神经递质释放、神经突触可塑性、缺血性神经保护等作用。腺苷是通过4个亚型受体(A1、A2A、A2B和A3)发挥药理活性,其中A1受体可以调节突触传导和神经元超极化,A2A受体调节神经递质释放,A2B受体调节cAMP水平和钙离子通道,A3受体调节神经突触可塑性[10]。虫草素是3′-脱氧腺苷,属于一种腺苷的衍生物,药物动力学显示腺苷衍生物是通过腺苷转运体经血脑屏障作用于中枢神经系统,它可以激活A1、A2A和A3受体,调节活性氧和钙离子信号通路,减少由内质网应激引发的半脫天冬氨酸蛋白酶12高表达,抑制神经细胞死亡,发挥神经保护作用[11]。此外，虫草素还可以激活T淋巴细胞,促进单核细胞分泌IL-10,从而降低TNF-α和IL-1b 表达水平,发挥抗炎症作用[12];虫草素还可逆转由脂多糖诱导NF-kB表达和抑制Akt与p38磷酸化,减少NOS1、NOS2转录表达,清除内源性NO,减轻海马神经氧化应激神经损伤,促进生长锥发育和树突棘形成[13-15];虫草素还能降低脑组织内谷氨酸盐和天冬氨酸盐水平,减少丙二醛的含量,激活超氧化物歧化酶,发挥神经保护作用[16-17];虫草素还可以清除活性氧自由基,抑制小胶质细胞激活,对神经细胞发挥保护作用[18]。虫草素的抗炎、抗自由基、免疫调节作用,有利于改善神经损伤区域微环境,促进神经系统运动功能恢复。

SynDIG1是最新发现与突触分化、发育密切相关的跨膜蛋白,具有介导神经快速兴奋性突触传递作用,参与调节学习记忆活动特性的调节蛋白,通过改变神经细胞SynDIG1表达水平显示兴奋性突触在数量和功能等方面出现显著变化。目前研究表明SynDIG1兴奋性突触传递与AMPAR有密切关系,当SynDIG1过表达时AMPA含量也随之增加,当敲除SynDIG1基因时AMPA含量也随之降低。在神经系统内AMPA受体主要分布在突触后膜上,它包含GluR1～GluR4 4个亚基,每个亚基由N端1个、跨膜区域3个、有孔发夹结构1个和C端1个构成[19],其中GluR1磷酸化水平与突触迁移和膜定位密切相关,在突触位点GluR1变化水平与LTP和LTD相关,即GluR1磷酸化水平越高,突触位点的LTP越强[20]。研究表明神经细胞经虫草素预处理后,可显著提升GluR1在小鼠前额叶皮层和海马体突触表达水平,但是GluR2表达水平则没有发生明显变化。虫草素可以通过特异AMPA受体亚基GluR1/3调控突触传导,GluR1 Ser845是一个蛋白激酶A位点,该位点磷酸化激活神经细胞内AMPA受体,增加受体在神经细胞膜嵌入,促进LTP的发生,且虫草素剂量越高、磷酸化作用越强、AMPA受体含量越多,且可发生反馈性作用,进而调节神经突触可塑性[21-23]。

免疫荧光、免疫印迹研究结果显示脊髓损伤后用虫草素可以促使神经细胞内SynDIG1大量表达,减少组织囊性空腔和减轻炎症细胞浸润情况。这是因为虫草素不仅可以清除过氧化物酶、激活超氧化物歧化酶、减轻钙超载、促使免疫细胞分泌抗炎因子,抑制细胞凋亡,而且它还可以促使GluR1磷酸化,提升GluR1表达水平,激活AMPA受体,从而反馈性促进SynDIG1大量表达,调节神经突触分化、发育及兴奋性传递作用,最终改善神经损伤区域微环境、有利于神经再生。

行为学实验结果表明,虫草素治疗脊髓损伤能有效促进动物的肢体运动功能恢复,并且在术后第14天动物的运动功能评分就已明显高于损伤组,神经系统功能恢复良好。虫草素对脊髓内SynDIG1表达的影响与其对运动功能恢复的影响表现出趋势一致,这个现象也从侧面说明脊髓内微环境得到了极大的改善,启动了内源性神经修复系统,但具体机制尚待进一步研究。

综上所述,虫草素明显改善损伤区域的微环境,激活神经系统的内源性修复机制,促进神经细胞SynDIG1大量表达,有利于神经再生及神经系统运动功能恢复。