ZENK蛋白在牛蛙脑中的免疫组织化学定位

任 敏 徐 冉 梁娟娟 张 方 晏 鹏 张盛周 吴孝兵

(安徽师范大学生命科学学院保护生物学教研室, 芜湖 241000)

ZENK基因,又称Zif268、Egr-1、NGFI-A、Krox-24(22-25)、ZNF225等[1],属于即刻早基因家族,是一种由3个锌指结构组成的锌指转录因子[2],其结构在黑猩猩、鼠、牛、鸟类和斑马鱼等多个物种中十分保守[3]。有关ZENK基因的研究主要集中在听觉诱导和声音刺激上。ZENK基因可以由环境刺激诱导而迅速表达[3],鸣禽鸣唱或听到另一同种个体鸣唱时,与发声交流相关的端脑中ZENK mRNA水平会迅速上升，用来识别和处理同种听觉信号[1]。ZENK基因的表达还与个体认知学习和记忆有关。鸣禽听到同种鸣曲重放时,脑中会迅速诱导ZENK基因的表达,同种鸣曲诱导ZENK基因表达最为显著,其次是异种鸣曲,而在纯音诱导下未发现ZENK基因的表达[1,4]。反复播放同一鸣曲后ZENK基因表达减少,但重新播放另一同种鸣曲仍能再次诱导ZENK基因的高表达[5]。

目前对于ZENK基因的研究主要集中在哺乳类和鸟类,而两栖类和爬行类的研究则较少。牛蛙是生物学实验中常用的实验动物,是良好的实验材料。本研究以美洲牛蛙(Rana catesbeiana)脑为研究对象,利用免疫组织化学研究ZENK蛋白在牛蛙脑中的分布与定位,可为进一步研究其在两栖类中的生理功能积累材料。

1 材料和方法

1.1 实验动物与组织处理

健康的成年美洲牛蛙(以下简称“牛蛙”)雌、雄共12只(夏季和冬季雌、雄蛙各3只),分别于2017年1月(冬季)和8月(夏季)购于安徽省芜湖市农贸市场。牛蛙经乙醚麻醉后,取出全脑(包括大脑、间脑、中脑、小脑和延脑),立即用4%多聚甲醛固定48h。梯度乙醇脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋。

1.2 组织切片和免疫组织化学显色

常规组织学切片,冠状连续切片,厚度为5μm,从每5个连续切片中选取1个切片用于免疫组织化学显色。组织切片经脱蜡和复水后,采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法进行显色(浓缩型SABC-POD试剂盒,SA2001,购于武汉博士德),方法如下： 用3%的H2O2孵育30min以阻断内源性过氧化物酶活性,PBS缓冲液冲洗2次后,用山羊血清封闭液孵育30min以阻断非特异性反应,滴加一抗(ZENK单克隆抗体,ab55160,购于Abcam公司,稀释倍数为1∶100)4℃过夜。滴加二抗、三抗后,用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(PA110,购于北京天根)显色10min,苏木精复染30s便于阳性反应的观察(用于光密度分析的切片则不作复染),脱水透明封片。每次实验均设置阴性对照,用PBS代替一抗,其余步骤同上。最后在Olympus BX 61显微镜下观察、记录、摄片。

1.3 光密度分析

利用Image-Pro Plus 6.0软件,对放大400倍的组织切片阳性部位进行光密度定量分析,测出阳性部位的面积和累积光密度,并计算出平均光密度(mean density, MD)。阳性反应越强烈,阳性部位的染色越深,其MD值越大。

1.4 统计学处理

以MD值的大小表示阳性反应的强弱,用SPSS软件进行t检验,比较ZENK蛋白在不同性别牛蛙脑中分布的差异显著性,当P<0.05或P<0.01时,为差异具有统计学意义。

2 结果

牛蛙属于无尾两栖类,其脑部结构较简单,包括大脑、间脑、中脑、小脑、延髓5个部分(图1)。在光镜下,可见明显的免疫组织化学棕黄色的阳性反应,经显微拍照和光密度分析后,牛蛙脑内ZENK蛋白的分布见表1。

图1 牛蛙脑部结构示意图

表1 ZENK蛋白在牛蛙脑中的分布

(续表1)

*P<0.05,**P<0.01vsfemale. Dc： dorsal cortex; Sep： septum; Str： striatum; Ph： primordial hippocampus; Ppa： primordial piriform area; Vtn： ventromedial thalamic nucleus; Pa： preoptic area; Hy： hypothalamus; Tec： tectum; Teg： tegmentum; Pg： pretectal gray; Natg： nucleus anterodorsalis tegmenti; Natc： nucleus anterovetralis tegmenti; Ml： molecular layer; Gl： granular layer; Pcl： Purkinje’s cellular layer; Ra： raphe nuclei; Rn： reticular nuclei; Stn： solit tract nucleus.

2.1 大脑

大脑由左右两个侧脑室构成,其结构相对于哺乳动物较简单。ZENK蛋白的阳性细胞主要存在于大脑的背侧皮质、原始海马、纹状体及原始梨状区。观察可见,夏季雌蛙和雄蛙的ZENK蛋白分布略有不同。夏季雌蛙在大脑的背侧皮质、纹状体中阳性细胞较多,染色最深,胞体和突起中均有很强的阳性反应,而夏季雌蛙在这些区域的阳性反应较弱(P<0.01)。夏季雌、雄蛙在原始海马和原始梨状区的阳性细胞略少,阳性反应较强,仅有胞体着色,少数细胞突起有较浅染色;在隔区的阳性反应最弱,染色较浅。冬季雌、雄蛙大脑中均未见阳性细胞(图2A～E,见封二)。

2.2 间脑

间脑位于大脑和中脑之间。此结构中,ZENK蛋白的强阳性反应主要出现在夏季雌、雄蛙的视前区和丘脑腹侧内核中,阳性细胞较多,染色较深,胞体和突起均有染色,且夏季雌蛙在视前区的阳性反应比雄蛙强(P<0.05)。在夏季雌、雄蛙的下丘脑中,阳性细胞较少,染色较浅,仅有细胞胞体着色。在冬季雌、雄蛙中未观察到明显的阳性细胞(图2F～G,见封二)。

2.3 中脑

中脑介于间脑与脑桥之间,背面分左右两叶,为一对卵圆状突起,称为中脑视叶,是两栖爬行类动物的高级中枢结构。在夏季雌、雄蛙的中脑中,阳性细胞广泛存在于各个区域,阳性反应较强。在视顶盖及中脑水管附近的一些被盖核团(包括背、腹前侧被盖核)中,阳性细胞胞体和突起均有较强的染色,在顶盖前灰质和被盖中胞体着色的阳性细胞较多,但染色较浅,阳性反应稍弱,仅有少量的细胞突起有阳性反应。此外,夏季雌蛙在背、腹前侧被盖核中的阳性反应比夏季雄蛙的强(P<0.05)。而冬季雌、雄蛙中脑内则未观察到阳性反应(图2H～L,见封二)。

2.4 小脑

小脑位于大脑半球后端,覆盖于延髓与脑桥之上,横跨于延髓、中脑两者间,其分化自胚胎初期的菱脑。夏季雌、雄蛙在小脑Purkinje细胞层阳性反应最强,胞体和突起染色均比较深。夏季雌蛙在小脑分子层和颗粒层阳性阳性反应较弱,阳性细胞较少,仅有胞体着色;而夏季雄蛙在分子层和颗粒层的阳性反应均强于夏季雌蛙(P<0.05)。观察可见冬季雌、雄蛙小脑中没有明显的阳性反应(图2M～N,见封二)。

2.5 延髓

延髓居于脑的最下部,上接脑桥,与脊髓相连。夏季雌、雄蛙延髓的中缝核、网状核以及孤束核内均有染色较深的阳性细胞,但在中缝核中夏季雄蛙的阳性反应强于夏季雌蛙(P<0.05)。中缝核附近的阳性细胞胞体和突起均有较强的阳性反应,而在孤束核和网状核中,阳性反应主要表现在胞体上,仅有少量突起有阳性反应,且染色较浅。在冬季雌、雄蛙延髓中仍未见有明显的阳性细胞(图2O～P,见封二)。

3 讨论

ZENK基因通常与神经元的活动紧密相关,能准确地反映细胞的活性位置[6],因此成为国内外学者研究的热点。本研究以牛蛙脑为研究材料,首次涉及ZENK蛋白在两栖类全脑中的分布与定位,对比分析了夏季和冬季雌、雄蛙脑中ZENK蛋白的分布差异。

3.1 牛蛙脑不同区域内的ZENK蛋白分布

鸟类的研究表明,ZENK蛋白在大脑纹状体中的阳性反应最为显著[1]。海马体和纹状体参与许多与学习记忆高度相关的认知功能[7],因此推测ZENK蛋白在牛蛙原始海马、纹状体分布较多与其运动及认知记忆有关。

蛙类的中脑和间脑都是主要的视觉中枢[8]。ZENK蛋白在南美泡蟾[9]和凹耳蛙[10]的中脑被盖及脑桥上橄榄核中有分布,这与本研究结果一致。研究表明,视网膜发出的视神经纤维会投射到丘脑、视顶盖和下丘脑上[11],因此ZENK蛋白在牛蛙丘脑及中脑中的分布可能与其视觉功能相关。

Long和Salbaum[12]利用原位杂交技术观察到ZENK基因在鸟类小脑颗粒细胞层中的显著表达。小脑与许多动物行为紧密联系,包括行为控制、语言、认知记忆、学习等[13]。因此牛蛙小脑中ZENK蛋白分布可能还参与了其对环境的认知、记忆及行为协调等方面的活动。

3.2 夏季、冬季牛蛙脑中ZENK蛋白分布

据观察,冬季牛蛙行动迟缓,而夏季牛蛙活动性较强,对环境中的刺激比较敏感。冬季蛙类多数有冬眠的习惯,此时生命活动处于极度降低的状态,代谢功能和神经活动都显著降低[14]。ZENK蛋白的分布与神经元活动密切相关,冬季牛蛙中未观察到ZENK蛋白阳性表达物可能与此时牛蛙极少的神经活动有关。

3.3 雌、雄牛蛙脑中ZENK蛋白分布

血浆中雌二醇的循环和听觉端脑中去甲肾上腺素的分泌可介导更强的ZENK蛋白的免疫反应[15]。雌二醇是由卵巢成熟滤泡分泌的一种自然雌激素[16],能作用于听觉端脑及其受体上,通过去甲肾上腺素能依赖过程影响ZENK基因的表达[17-18],因此雌性牛蛙在大脑和间脑视前区ZENK蛋白分布较多可能与其脑中雌二醇的分泌有关。中缝核群能够参与性行为的调节[19],夏季雄蛙处于性行为较活跃的繁殖期,研究表明ZENK基因的表达与鸣禽求偶行为的强度成正相关[20],因此雄蛙小脑和延髓中缝核区ZENK蛋白分布较多可能也与其求偶、交配等繁殖行为有关。

综上所述,牛蛙脑中ZENK蛋白分布与其他动物有一定的相似性,在脑中参与调控动物的多种行为。ZENK蛋白在不同季节牛蛙脑中的分布差异可能与其脑内的神经活动有关,不同性别牛蛙脑中ZENK的蛋白分布差异可能与其雌二醇分泌及活跃的性行为相适应。但ZENK基因在牛蛙脑中是如何参与认知、运动等行为调控的,还有待更深入的研究。