克老素在脊髓损伤中的表达及相关性分析❋

杨 宁 董 彬 傅 莉 王嘉钰 黄 煜 任丽莉 金梅花 韩东河

(锦州医科大学基础医学院, 锦州 121001)

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是脊柱损伤的严重并发症,目前国内外治疗SCI的药物和外科手术均未取得令人满意的临床疗效[1-2]。脊髓损伤后数小时到数周之内,即继发性损伤,会发生一系列神经细胞和分子水平上的病理反应,引起细胞进一步坏死和凋亡,最终形成髓鞘剥脱和轴突的萎缩退变[3-5]。近年来,一些研究指出,抗衰老基因克老素与神经退行性疾病有着密切的相互联系,可能通过抗氧化应激、抗细胞凋亡发挥其抗衰老的作用[6-8]。已知克老素基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,表现为其认知功能障碍,且认知障碍的克老素基因敲除小鼠出现凋亡细胞数的增加，海马内脂质和DNA氧化水平显著提高,但克老素在中枢神经系统中的表达以及神经损伤中的作用及机制尚不清楚。为此,本研究将利用脊髓损伤动物模型,观察克老素在脊髓神经元中的表达变化,分析克老素的表达变化与神经损伤之间的相关性。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

50只清洁健康2月龄雄性SD大鼠,体质量(200±20) g,均由锦州医科大学实验动物中心提供,动物许可证号： SCXK(辽)2003-0007。将大鼠随机分为正常对照组(Sham)，损伤1周、2周、4周组(SCI 1 week, SCI 2 weeks, SCI 4 weeks)。

1.2 建立SCI动物模型

在腹腔注射4%水合氯醛(5ml/kg)进行麻醉,对大鼠背部脱毛、常规消毒、铺洞巾,将大鼠俯卧位并固定于立体定位仪上;以第9胸椎(T9)棘突为中心,尖刀背部纵行切开长2～3cm创口,钝性分离皮下组织和肌肉,暴露脊柱椎骨T8～T10棘突和椎板,用咬骨钳慢慢咬除椎板并暴露硬脊膜;用宽度1.0mm的动脉瘤夹(规格为50g力),压迫T9～T10段脊髓1min;大鼠随即出现摆尾、双后肢和躯体抽缩扑动后,双后肢瘫痪;观察并止血,盐水冲洗切口,用手术线分层缝合肌肉软组织及皮肤,模型制作完成。模型制作完成后,立即腹腔注射37℃生理盐水5ml以补充丢失的体液。术后24h内,注意保温并严格术后观察。术后常规护理以青霉素4×104U/d,连续5d。每天各在早晚8：00定时以膀胱按摩协助大鼠排尿,直到本实验结束。Sham组仅打开椎板,然后缝合。

1.3 RT-PCR法检测克老素基因的变化

根据产品说明书,提取组织总RNA,取约1μg总RNA,进行逆转录。在PCR仪上设定逆转录反应条件： 37℃ 10min,42℃ 30min,70℃ 5min,4℃。取1μl 合成好的cDNA,配好PCR反应液,进行扩增。克老素引物序列(5′-3′)为： Forward： CAATGGCTTCC CTCCTTTAC,Reverse： AGCACAGGTTTGCGTAG TCT(450bp)。内参GAPDH引物序列 (5′-3′)为： Forward： CTACCCACGGCAAGTTCAAT, Reverse： GGATGCAGGGATGATGTT(478bp)。PCR反应条件： 克老素为94℃ 30s, 55℃ 40s,72℃ 1min,29个循环;GAPDH为94℃30s, 55℃ 40s,72℃ 1min,29个循环。将PCR产物进行电泳,并对PCR电泳条带进行灰度分析,以GAPDH作为内参,根据目的基因灰度值/内参灰度值,计算出克老素基因的相对表达量。

1.4 免疫荧光染色法观察克老素在脊髓的表达变化

各组脊髓组织切片,经固定、封闭后,用兔抗大鼠Klotho(1∶100,美国Abcam)4℃孵育过夜,予羊抗兔 FITC-IgG(1∶100,美国Abcam)避光室温孵育(未行DAPI核染色), 封片剂封片后在激光共聚焦显微镜(德国Zeiss)下观察并拍照。

1.5 蛋白印迹检测克老素的表达变化

各组脊髓组织剪碎后加入全蛋白裂解液, 提取总蛋白,用BCA法进行定量,将蛋白浓度最终定为0.8μg/μl，取10μg行SDS-PAGE,转至PVDF膜,用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h;TBST洗膜,一抗Klotho(1∶500)4℃孵育过夜;洗膜3次,相应二抗(1∶2000)室温孵育2h,洗膜3次;暗室ECL发光显色、曝光、拍照,Image J分析结果。

1.6 ELISA法检测大鼠脊髓损伤后氧化损伤程度

取大鼠脊髓组织蛋白液,利用稀释液1∶5稀释蛋白提取液,检测8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量,并按试剂盒说明书操作。每份样本做2个平行样。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠脊髓组织中克老素mRNA的表达变化

结果显示,损伤组大鼠脊髓中克老素基因表达较假手术组低,并并随损伤时间的延长,呈波动性改变,在损伤后1周开始减低,4周时减少到最低(图1)。

图1 克老素mRNA在脊髓损伤中的表达变化

2.2 大鼠脊髓组织中克老素蛋白的表达变化

免疫荧光法检测结果显示,克老素在脊髓神经组织中表达,且荧光强度随病程增加,逐渐减弱(图2)。蛋白电泳定量分析结果显示,损伤组大鼠脊髓中,克老素蛋白表达较假手术组明显降低,并随损伤时间的延长,呈波动性改变,在损伤后1周开始减低,4周时减少到最低(图3)。

图2 克老素蛋白在脊髓组织中的表达,标尺=100μm

图3 克老素蛋白在脊髓损伤中的表达变化

2.3 大鼠脊髓组织中8-OHdG含量

结果显示脊髓损伤组大鼠脊髓中8-OHdG表达水平较假手术组高,并随损伤时间的延长,呈波动性改变,在损伤后1周开始增高,4周时增加到最高。差异有统计学意义(P<0.01)(图4)。

图4 8-OHdG在脊髓损伤中的表达变化

2.4 克老素与8-OHdG相关性分析

克老素表达(变量X)与8-OHdG浓度(变量Y)进行相关性分析结果显示两变量呈负相关关系(r=-0.898,P<0.01,n=24)(图5)。

图5 克老素与8-OHdG相关性分析

3 讨论

脊髓损伤后局部微环境变化的大量研究指出,氧化应激是加剧脊髓损伤后诱导神经细胞和少突胶质细胞凋亡的主要因素。尤其在神经组织退化过程中小胶质细胞通过释放促炎细胞因子(肿瘤坏死因子α,白介素6等)和活性氧(ROS),在诱导炎症反应中发挥了举足轻重的作用[8]。这些因素不仅直接破坏脊髓组织,而且通过介导反应性胶质化阻止神经再生抑制修复,最终导致瘢痕形成,细胞死亡[7]。抗衰老基因——克老素,最初是由日本科学家Makoto Kuro-o在1997年研究时偶然发现的,后命名为Klotho基因。随后经研究进一步确认,表明Klotho基因敲除鼠(KL-/-)具有类似人类衰老的表型,如个体寿命的缩短、身长及体质量的明显降低、动脉粥样硬化、皮肤黏膜和肌肉的萎缩、软组织钙化、骨质疏松等[9]。近年来,研究表明克老素在中枢神经系统中也发挥着重要的调节作用[12-13]。如精神认知功能的障碍、大脑运动神经元功能障碍、听力异常等神经功能障碍[10-11],但克老素在脊髓组织中的表达研究甚少。

本实验结果表明,脊髓损伤后大鼠脊髓组织中的克老素表达较正常组及假损伤组明显减弱,且克老素的表达随着脊髓损伤的病理进程逐渐减弱,提示脊髓损伤后大鼠脊髓组织中克老素参与脊髓损伤修复的病理过程。最近有研究指出克老素蛋白过表达,可以明显减少血管内皮细胞的氧化应激,胞内的凋亡分子caspase-9的活性也随着明显降低[14-15]。本研究结果显示,细胞内DNA氧化损伤指标8-OHdG的表达随脊髓损伤的病理过程而增高,且与克老素的表达呈负相关关系，提示克老素可能具有神经保护作用。根据上述结果,脊髓损伤神经元的凋亡的增加是否与克老素的表达具有直接关系,尚不清楚。因此,进一步在体内外实验中利用基因过表达或沉默技术,调控克老素的表达,验证克老素与大鼠脊髓中神经细胞的凋亡及运动功能的改变,将具有重要的研究意义。