新城疫病毒抗肿瘤研究进展

王贝贝，宋丽丽，马德慧，东彦新，王学理



新城疫病毒抗肿瘤研究进展

王贝贝，宋丽丽，马德慧，东彦新，王学理

内蒙古民族大学 动物科技学院，内蒙古 通辽 028042

王贝贝, 宋丽丽, 马德慧, 等. 新城疫病毒抗肿瘤研究进展.生物工程学报, 2018, 34(9): 1432–1441.Wang BB, Song LL, Ma DH, et al. Progress in Newcastle disease virus against tumor. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1432–1441.

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) 为副黏病毒科，禽腮腺炎病毒属 (Avulavirus) 的禽副黏病毒Ⅰ型 (APMV-Ⅰ)，可对250多种禽类造成致死性感染，给世界范围内的家禽养殖造成了巨大损失。目前，研究发现NDV对人肿瘤细胞具有溶瘤作用，能够选择性地在癌细胞中复制。并且一些研究已经进行了人体临床试验，取得了良好的效果。因此，新城疫病毒是肿瘤治疗的潜在治疗剂。文中就NDV结构蛋白与毒力的关系、NDV直接溶瘤作用、NDV为载体的肿瘤基因治疗、NDV抗肿瘤与自噬等进行了综述。

新城疫病毒，溶瘤作用，自噬，肿瘤基因治疗

恶性肿瘤严重威胁人类健康。目前对肿瘤的治疗主要依赖于手术、放疗和化疗等方法。20世纪 50 年代，人们发现NDV能抑制胃癌转移，因此NDV可作为一种新兴的肿瘤生物治疗因子，其本身的高靶向性以及分子生物技术的成熟使其在肿瘤治疗中的应用研究越来越深入。NDV能够通过直接溶瘤作用杀死肿瘤细胞，也可通过感染自体肿瘤细胞制成疫苗对患者进行特异性免疫治疗，NDV的抗肿瘤特性为恶性肿瘤的治疗开辟了崭新的道路。

1 病毒结构蛋白与毒力的关系

NDV又称亚洲鸡瘟病毒或伪鸡瘟病毒，属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属。该病毒主要危害家禽，且传播迅速。NDV为单股负链RNA病毒，编码6种结构蛋白和至少2种非结构蛋白，其中，F蛋白和HN蛋白是病毒粒子表面的2种纤突蛋白，是NDV感染宿主细胞的主要毒力因子。

NDV的HN蛋白可激活自然杀伤细胞 (Natural killer cell，NK细胞) 以及T细胞[1]，HN蛋白位于病毒囊膜外表面，对受体裂解、受体结合和激活F蛋白起到至关重要的作用[2]。新城疫病毒HN蛋白在病毒进入和成熟过程中发挥着一定的作用，包括与唾液酸受体的结合、激活F蛋白促进膜融合、在病毒出芽时促进病毒粒子释放。在无毒的NDV毒株中，HN直接影响毒力。诸如NDV Ulster株，除去C-末端的延伸HN蛋白将被酶解激活，这种情况在其他的NDV HN蛋白中未被发现。Ulster毒株HN蛋白有616个氨基酸，在它的前体HN0有45个氨基酸C-末端延长，HN0切割后HN才具有活性。Ulster毒株HN在氨基酸残基596的C-末端延伸处含有1个二硫键，该二硫键调节HN活性和神经氨酸酶 (Neuraminidase，NA) 二聚体结构域。新城疫病毒HN蛋白中的二级唾液酸结合位点和C-末端的延伸也有关联，C-末端延伸位于NA结构域的二聚体界面，最有可能阻碍其依附功能。以上研究阐明Ulster毒株HN的C-末端残基导致HN的自动抑制状态、是HN0裂解的必要条件以及导致相关的毒力降低[3]。

Heiden等构建了一个重组病毒，重组病毒主要由新城疫病毒clone-30的主要序列和来自于一个鸽副黏病毒的F蛋白序列构成，此鸽副黏病毒的脑内接种致病指数 (Intracerebral pathogenicity index，ICPI) 为1.1，F蛋白裂解位点序列为R-R-K-K-R*F，构建的重组病毒ICPI为0.6，说明重组病毒致病性减弱。相比之下，弱毒株clone-30的裂解位点由G-R-Q-G-R*L变为R-R-K-K-R*F，裂解位点改变后病毒的ICPI为1.36，说明新城疫病毒的毒力除了和F蛋白的裂解位点有关，还受多元因素的调控[4]。目前研究已经证实F蛋白基因胞质尾 (Cytoplasmic tail，CT) 氨基酸和病毒复制与致病机理有关，通过回补缺乏2个或4个残基 (rΔ2和rΔ4) 的病毒突变体，进一步利用这4个末端残基(rM553A、rK552A、rT551A、rT550A) 中的单个氨基酸替换来回补病毒突变体。新城疫病毒F蛋白CT有两个保守的酪氨酸残基 (Y524和Y527) 和一个双亮氨酸 (LL536-537)。对于其他的副黏病毒，这些氨基酸被证明影响融合活性，是基底靶向的核心要素。2个和4个CT氨基酸的缺失与单酪氨酸替换导致超膜融合现象并增进了病毒的复制。进一步研究发现，在有酪氨酸残基rY524和rY527的病毒中，干扰靶向信号并没有减少在分化的犬肾传代细胞顶端或基底表面的表达，而双酪氨酸突变体在分化的犬肾传代细胞顶端或基底表面的表达减少了。有趣的是，对于rL536A 和rL537A突变体，F蛋白在顶端的表达高于在基底表面的表达，这种影响在rL537A突变体更为明显。因此说明新城疫病毒F蛋白CT的这些野生型残基对F蛋白生物学功能有一定的调节作用，从而调节病毒复制和发病机制[5]。

2 NDV的直接溶瘤作用

2.1 直接溶瘤效果

不同NDV毒株的溶瘤能力也不相同，强毒力毒株强于中等毒力毒株，中等毒力毒株强于弱毒株，同一毒株由于其浓度与作用时间的不同，溶瘤效果也不相同，浓度越大，作用时间越长，效果越显著。溶瘤病毒感染肿瘤细胞后，活化了病毒的主要毒力因子，子代病毒可继续感染邻近细胞，因而细胞毒性较强。最理想的抗肿瘤效果是依靠对肿瘤抗原产生特异性识别的T细胞，如记忆性T细胞、CD4辅助性T细胞和CD8细胞毒性T细胞。

在NDV抗肿瘤机制中，T细胞及巨噬细胞数量的增加以及机体抗肿瘤作用的增强是重要的抗瘤因素。新城疫病毒可增强人类的抗肿瘤免疫，尤其可增强肿瘤特异性CTL的反应和活力[6]，其机制可能与新城疫病毒HN蛋白能被免疫系统识别并增强免疫系统对肿瘤细胞的细胞毒性有关[7]。

为了观察腹腔注射NDV对小鼠脾脏NK细胞的表达、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL) 及杀伤Novikoff小鼠肝癌细胞的影响，并探讨其与γ干扰素(FN-γ) 的关系，Song等对BALB/c小鼠和IFN-γR–/–B6.29S7小鼠腹腔注射NDV，12 h后，用ELISA、反转录PCR、Western blotting以及乳酸脱氢酶 (LDH) 释放法检测小鼠外周血IFN-γ浓度、NK细胞中TRAIL mRNA转录水平、脾脏NK细胞中TRAIL蛋白水平、NK细胞对Novikoff肝癌细胞的杀伤作用。结果显示以上实验指标均上调，且TRAIL中和抗体能抑制NK细胞对Novikoff肝癌细胞的杀伤作用。IFN-γR–/–B6.129S7小鼠经NDV注射后脾脏NK细胞的TRAIL表达无显著增加[8]。高翠等为了研究NDV弱毒株HBNU/LSRC/F3对人食管癌ECA109细胞凋亡的影响，并与其他两株弱毒株、中等毒力株NDV的抗肿瘤作用进行了比较。研究发现，弱毒力HBNU/LSRC/F3 株可有效诱导ECA109细胞早期凋亡，抑制其增殖，虽略低于中等毒力Mukteswar株，但远高于弱毒疫苗LaSota株[9]。

张春晓等[10]通过用免疫荧光染色法、Transwell法、蛋白印迹法、明胶酶谱法等检测NDV D90对细胞微管和微丝形态的改变、对HN-6细胞迁移和侵袭率的抑制作用、对RECK、SP1、MMP-2和MMP-9表达的影响以及MMP-9、MMP-2活性的改变。结果表明，NDV D90能够有效地抑制口腔鳞癌细胞系HN-6的迁移和侵袭。

2.2 天然免疫在病毒溶瘤中的作用

天然免疫作为防御病毒的第一道防线，限制了病毒的复制和传播，而适应性免疫在再次感染期间对病毒起着主要作用。抗体可能潜在地会中和溶瘤病毒，大大减少肿瘤部位的病毒剂量[11]。尽管天然免疫力限制了NDV在肿瘤中的复制，但并未影响肿瘤细胞清除率、间接抗肿瘤免疫效果和溶瘤病毒的存活率。天然免疫力可通过增强全身性抗肿瘤特性来提高NDV的治疗效力[12]，研究发现，NDV活化的免疫细胞能够抑制肿瘤，在Panc02肿瘤中大量活化的NK细胞抑制了肿瘤细胞的生长[13]。在细胞的天然免疫中，自然杀伤 (NK) 细胞具有强效的抗肿瘤以及抗病毒作用。病毒感染癌细胞下调其Ⅰ类主要组织相容性复合物 (MHC)，使其成为NK细胞的良好靶标。尽管NK细胞可能杀死感染的癌细胞并限制溶瘤病毒的复制，但研究发现NK细胞通常对溶瘤病毒的治疗效果具有促进作用。此外，NK细胞还在树突状细胞 (DC) 的成熟过程中发挥作用，它们还可以通过分泌IFN-γ和TNF-α诱导癌症干细胞以及低分化癌细胞。一些研究表明，NK细胞与溶瘤病毒的联合可以导致协同抗肿瘤作用。当溶瘤病毒感染的细胞被吞噬时，病毒被抗原递呈细胞直接通过胞吞作用吸收，或者间接地将病毒抗原呈递给T细胞，并最终激活免疫系统对病毒的适应性。尽管获得适应性免疫，但大多数研究表明适应性免疫增强了溶瘤病毒的治疗结果[14]。

2.3 联合治疗

自2011年批准抗CTLA4 (伊匹单抗) 治疗晚期黑色素瘤以来，抗癌免疫治疗药物的开发蓬勃发展。许多免疫检查点抑制剂的成功开发彻底改变了癌症治疗的格局。对于某些类型的癌症，针对免疫检查点途径的单一疗法已被证明比传统疗法更有效，并且将免疫疗法与当前的治疗策略相结合可能会产生更好的结果。许多临床前研究表明，联合免疫治疗和放疗可能是协同增强治疗效果的有前途的策略。肿瘤部位的放疗会影响肿瘤细胞和周围的基质细胞。放射诱导的癌细胞受到损伤后暴露了肿瘤特异性抗原，使其可被免疫监视，并促进细胞毒性T细胞的激活。辐射诱导的肿瘤微环境调节也可以促进免疫细胞的聚集和浸润。增强的肿瘤识别和免疫细胞靶向性可以激活免疫系统以消除癌细胞。然而，挑战仍然有待解决，在未来以期待最大限度地发挥这种组合功效[15]。

3 NDV为载体的肿瘤基因治疗

溶瘤病毒 (Oncolytic virus，OV) 之所以可以治疗肿瘤，首先是毒性有限，其次可在肿瘤中选择性地复制。而天然NDV就具备以上两个特点，有肿瘤选择性和细胞毒性而在正常细胞中复制将会受到限制。大量临床试验发现NDV需要进一步增强其对肿瘤的靶向来提高治疗效果。由于先天性免疫、补体、细胞外基质等影响，NDV到达肿瘤时无法达到有效的治疗浓度，并且在肿瘤内扩散不良。解决这些问题对于提高NDV的溶瘤效果至关重要，为了获得良好的特异性和治疗效果，研究发现重组新城疫病毒可以有效改善溶瘤效果[16]。

对于病毒反向遗传系统的建立能够进一步增强操纵病毒的溶瘤活性。为了提高重组NDV抑制肿瘤的效果，Niu等构建了prNDV-IL15重组质粒，转染BHK21细胞后测定了病毒生长曲线。通过ELISA法和MTT比较法来检测细胞上清液中IL15的表达量以及rNDV-IL15和rNDV在体外抑制B16F10细胞的效果，且比较了两者在黑色素肿瘤荷瘤小鼠的疗效。研究结果表明，插入IL15对病毒生长无影响，IL15在细胞上清液中表达量较高，rNDV-IL15和rNDV对B16F10细胞的抑制率与时间相关，但两者的抑制率差异并不显著[17]。为了解决NDV溶瘤细胞效率低下的问题，Zamarin等构建了一个表达流感NS1蛋白的重组NDV，重组病毒形成合胞体的能力显著增强，可溶解多种人类和小鼠的肿瘤细胞系，并抑制细胞诱导的干扰素反应。使用同系的小鼠黑色素瘤模型发现，对于足部的肿瘤，NDV-NS1重组病毒比NDV对肿瘤的溶解更为有效，且使动物寿命更长。此外，用NDV-NS1治疗的小鼠没有任何中毒的迹象，并且呈现出T淋巴细胞(CTL) 反应[18]。He等验证了一种腺病毒的抗肿瘤溶瘤能力，在人类端粒酶逆转录酶 (hTERT) 启动子上表达新城疫病毒的HN基因(Ad-hTERTp-E1a-HN)，来抑制体外培养的食管癌EC-109细胞，降低移植瘤BALB/c裸鼠的肿瘤负荷。在体外，Ad-hTERT-E1a- HN的感染可以显著抑制EC-109细胞的生长，并保护正常人肝细胞系L02免受3-(4,5-二甲基噻唑- 2-烃基)-2,5-二苯基四唑溴化物 (MTT) 损伤。Ad-hTERT-E1a-HN还有效选择性地降低EC-109细胞的唾液酸水平，而不是在L02细胞上降低唾液酸水平。此外，通过吖啶橙和溴化乙锭染色 (AO/EB染色) Ad-hTERT-E1a-HN显示诱导凋亡途径，增加了活性氧 (ROS)，降低了线粒体膜电位并释放细胞色素c。在体内，对BALB/c裸鼠通过肿瘤内或静脉内注射Ad-hTERT-E1a-HN，尽管两种治疗方式在肿瘤体积方面均显示出明显的抑制作用，但通过肿瘤内注射Ad-hTERT-E1a-HN对治疗产生完全反应[19]。Wei 等用反向遗传学技术产生重组rNDV-18HL。通过蛋白质印迹、酶联免疫吸附试验、Transwell侵袭试验和表面等离子体共振技术鉴定了病毒表达cHAb18抗体的特征，其生物分布用活体成像和免疫组织化学进行了评定。结果表明，在rNDV-18HL感染的细胞中产生的cHAb18通过细胞溶解释放到上清液中。rNDV-18HL编码的cHAb18抗体对CD147保持亲和力，并显示抑制HCC细胞的迁移和侵袭。通过嵌入cHAb18基因，病毒复制和毒力没有减弱，这显著增强了对残存肿瘤细胞迁移的抑制。选择性复制的rNDV-18HL原位肝癌移植瘤导致cHAb18原位表达，其进一步诱导肿瘤坏死，减少肝内转移并延长小鼠的存活[20]。

重组NDV作为杀死癌细胞疗效显著且可有效避免单一NDV溶瘤效果的弊端。Bai等通过将白细胞介素-2 (IL-2) 和凋亡相关的肿瘤坏死因子插入到NDV，构建重组rNDV诱导配体的产生。结果发现rNDV表达的IL-2和配体 (rNDV-IL-2-TRAIL) 通过诱导细胞凋亡能够显著提高rNDV的抗肿瘤效果[21]。Castano等为了增强对黑色素瘤的溶瘤效果，构建了编码人肿瘤坏死因子受体Fas的重组新城疫病毒(rNDV-B1/Fas)。rNDV-B1/Fas复制到与rNDV-B1相似的滴度，在受感染的细胞中Fas的过度表达导致更快、更高水平的细胞毒性，增加了细胞凋亡反应，内源性和外源性通路都被激活。此外，同系小鼠黑色素瘤模型的体内研究表明rNDV-B1/Fas的溶瘤特性增强，在生存和肿瘤缓解方面有重大改善。研究数据表明，上调新城疫病毒的促凋亡作用来增强其抗肿瘤性能是一种可行的方法[22]。Buijs等对表达干扰素 (rNDV-hIFNβ-F 0) 或IFN拮抗蛋白 (rNDV-NS1-F 0) 以及毒力增强的rNDV-F 3aa重组新城疫病毒就人胰腺癌细胞发挥溶瘤作用进行了评价。附加蛋白表达不妨碍病毒复制或细胞毒作用。然而，表达的干扰素导致多复制损失。相反地，重组新城疫病毒rNDV-F 3aa提升了病毒的复制。给肿瘤细胞注射rNDV-hIFNβ-F0后产生了高剂量的Ⅰ型干扰素，而给肿瘤细胞注射rNDV-NS1-F 0导致大多数细胞干扰素产生阻滞。用rNDV-F 3aa接种人胰腺癌细胞较rNDV-F 0引起了更为明显的细胞毒性。小鼠皮下胰腺癌异种移植的体内实验研究表明只有瘤内注射rNDV-F 3aa才会导致肿瘤消退[23]。以上结果揭示尽管弱毒型重组rNDVs调节Ⅰ型干扰素通路蛋白有特异性杀伤作用，中强毒株重组rNDVs有着更好的溶瘤疗效。Altomonte等也报道了一种在基因内有L289A突变的NDV，和rNDV/F3aa进行对照，增强了体外培养的肝癌细胞的融合和细胞毒性。rNDV/F3aa (L289A)体内给药，经肝动脉灌注免疫能力强的布法罗大鼠，导致肝肿瘤特异性合胞体形成和坏死，没有对邻近肝实质造成毒性损害。与此同时延长了大鼠的存活时间。实验表明 rNDV/F3aa (L289A) 是安全的，能比野生型NDV更有效地治疗肝癌[24]。Sánchez等[25]研究了减毒弱毒株NDV-MLS对人B细胞淋巴瘤细胞(SU-DHL-4) 以及犬源性B细胞淋巴瘤细胞的溶瘤效果，将其与健康人和犬外周血单核细胞 (PBMC) 进行比较。和未经处理的对照组相比，NDV-MLS降低了人 (42%±5%) 和犬 (34%±12%) 肿瘤细胞的存活率，对外周血单核细胞无明显影响。通过流式细胞仪检测肿瘤细胞出现凋亡。在犬T细胞淋巴瘤静脉注射1×1012TCID50NDV-MLS，24 h后通过免疫组化或端点PCR检测，仅在肾脏、唾液腺、肺和胃发现病毒。以上实验表明NDV-MLS用于治疗淋巴瘤是有前景的，未来的研究需要阐明最佳的治疗方案并制定适当的生物安全措施。

尽管对NDV进行了Ⅰ/Ⅱ期临床治疗癌症试验，但仍需进一步改进肿瘤特异性靶向治疗以提高其治疗指数。系统递送新城疫病毒在治疗浓度方面未能到达实体肿瘤，同时也由于补体、先天免疫和细胞外基质等影响病毒在肿瘤内扩散不良。Shobana 等用NDV设计了一种重组NDV (rNDV)，其F蛋白由前列腺特异性抗原 (PSA) 裂解。rNDV在前列腺癌(CaP) 细胞和立体的前列癌细胞球中高效、特异地复制，但在没有PSA的情况下无法复制。通过模拟合成雄激素类似物 (R1881) 诱导细胞内PSA生成，提高了在雄激素应答的CaP细胞中的细胞融合。更进一步的，rNDV引起雄激素非依赖性特异性溶解以及一个半数有效浓度 (EC50) 从0.01到0.1的多重感染，雄激素应答/无应答CaP细胞和前列癌细胞球。这种F蛋白由PSA裂解的重组NDV有效地裂解了前列癌细胞球肿瘤病变。PSA裂解的NDV在鸡胚内复制失败，说明对鸡胚无致病性。由于限制肿瘤复制和提升细胞融合，前列腺特异抗原靶向可能提高rNDV治疗指数[26]。Yan等将重组NDV (RL-RVG) 注入到小鼠肺腺癌A549细胞肿瘤中，探讨其对小鼠细胞增殖和免疫应答的影响。随着RL-RVG的转染及RVG和NDV基因表达，肿瘤生长减少，皮下肿瘤坏死，肿瘤细胞凋亡和自然杀伤细胞数量增多[27]。RL-RVG转染有效地抑制了肺腺癌A549细胞在体内的生长，说明与诱导肿瘤细胞凋亡和调节细胞免疫反应有关联。

肿瘤微环境的复杂性包括缺氧的区域。在这些区域，转录因子、缺氧诱导因子 (HIF) 主动调节许多基因的表达，这些基因有助于侵袭性的恶性肿瘤、放射和化疗耐药。通过使用缺陷型或重组野生型基因 (Von Hippel-Lindau) 的肾细胞癌 (RCC) 细胞株来研究HIF-2α存在或缺乏情况下高致病性NDV的溶瘤效果。研究发现，这些RCC细胞对新城疫病毒有应答作用仅产生干扰素IFN-β而不是IFN-α，并且与STAT1磷酸化增加相关。野生型基因表达提高了新城疫病毒诱导IFN-β的产生，导致STAT1的磷酸化延长和细胞死亡增加。缺氧增强了新城疫病毒的溶瘤活性[28]。

4 新城疫抗肿瘤与自噬

NDV感染肿瘤细胞，可以诱导宿主细胞产生多种细胞因子，如：干扰素(Interferon，IFN)、白细胞介素(Interleukin，IL)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子 (Granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF) 等，这些细胞因子又会激活巨噬细胞，致敏T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞等，从而增强机体免疫。

自噬是将细胞质蛋白及细胞器进行自我吞噬并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，通过在降解包裹物过程中释放能量来满足细胞本身的代谢和某些细胞器更新所需能量。正常情况下，自噬可通过降解受损细胞器以及长寿命蛋白和蛋白聚合物来调控细胞的稳态。还可通过限制炎症、清除有毒未折叠蛋白、除去生成活性氧簇的损伤线粒体来抑制肿瘤形成；肿瘤形成后，自噬将会为癌细胞提供更丰富的营养来支持肿瘤生长。因此，在肿瘤形成过程中自噬是一把双刃剑。

细胞死亡被细分为细胞凋亡 (Ⅰ型)、自噬性细胞死亡 (Ⅱ型) 和坏死 (Ⅲ型)。Ⅰ型和Ⅱ型细胞死亡之间的界限并不完全清楚。目前研究发现，参与细胞凋亡的信号转导途径包括：细胞外源性途径，即细胞膜上死亡受体激活Caspase8，Caspase8激活效应Caspase，引发蛋白水解级联反应，促使细胞凋亡；另一种是内源性途径，即线粒体内细胞色素c释放到胞浆形成凋亡复合小体，活化的 Caspase9激活效应Caspase，促使细胞凋亡；内源性通路与外源性通路同时参与凋亡的启动，除以上两种途径外，内质网的应激也被认为参与肿瘤细胞的凋亡。

IRE1-JNK信号通路起到内质网应激自噬开关的重要作用。Bu等发现重组无毒新城疫病毒 (NDV) LaSota株表达的狂犬病毒糖蛋白 (RL RVG) 可诱导胃癌细胞凋亡和自噬。并探讨了上游调节因子、内质网应激诱导自噬和凋亡及其相互关系。RL狂犬病病毒糖蛋白从三方面增加了内质网应激 (ATF6通路、肌醇需要酶1 (IRE1)、PKR-like内质网蛋白激酶 (PERK)) 以及自噬与凋亡的上游调控[29]。Jiang等通过观察绿色荧光蛋白微管相关蛋白1的轻链3，在小鼠耐药肺癌细胞中，对自噬抑制剂氯喹(CQ)和自噬诱导物雷帕霉素NDV/FMW就协调抗肿瘤活性进行了评估。结果表明NDV/FMW通过抑制自噬的Ⅰ类PI3K/ Akt/mTOR/p70S6K通路来触发A549/PTX细胞中的自噬。相反，NDV/FMW感染通过负调节通路的激活减弱了A549/DDP细胞中的自噬过程。此外，与CQ组合或敲除ATG5可显著增强NDV/FMW介导的抗肿瘤作用，而雷帕霉素可以显著提升NDV/FMW在A549/PTX细胞中的溶瘤功效。另一方面，在这些耐药细胞中自噬调节不会增加子代病毒。此外，CQ或雷帕霉素显著增强NDV/FMW对A549/DDP及A549/PTX细胞的溶瘤活性[30]。以上研究表明自噬调节剂的联合治疗是增强NDV/ FMW对耐药性肺癌治疗的有效策略。在电子显微镜下，新城疫病毒感染和饥饿诱导比模拟感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) 细胞具有较高的自噬体形成。NDV感染CEF细胞显示增强微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ (LC3-Ⅰ) 转换为LC3-Ⅱ和p62/SQSTM1的降解。通过紫外线灭活新城疫病毒感染细胞，LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ、Caspase 3及多聚 (ADP-核糖) 聚合酶 (PARP) 的减少表明，自噬体的形成对新城疫病毒的复制是必要的。氯喹对细胞自噬的抑制作用增强了细胞凋亡，导致Caspase 3和PARP裂解增加。在新城疫病毒感染的脾和肺组织中，雷帕霉素诱导的自噬导致除了Beclin 1、抗凋亡因子和炎性细胞因子外其余所有自噬相关基因上调，NDV感染脾脏和肺脏比模拟感染器官细胞凋亡减少。泛caspase抑制剂ZVAD-FMK促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换、p62/SQSTM1的降解，通过抑制凋亡NDV进行复制[31]。研究结果显示，抑制凋亡可增强自噬，促进细胞存活和新城疫病毒的复制。Meng等发现NDV感染U251细胞，不久即可引起该细胞自噬体的形成。通过增加双膜囊泡的数量表明，GFP-LC3形成并促进LC3-Ⅱ量的提升。此外，在新城疫病毒诱导的自噬和病毒复制中，Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶 (PI3K)/蛋白通路发挥着重要作用[32]。NDV/FMW引发肺癌球体caspase依赖的细胞凋亡表明增加了Caspase 3的处理和PARP裂解。尤其是NDV/FMW感染导致LC3-Ⅱ和P62的退化，两个自噬成熟的特征标志NDV/FMW在肺癌细胞中促进了自噬。结果表明NDV/FMW通过AKT/mTOR通路抑制促进自噬降解肺癌细胞[33]。

5 应用前景

在过去几年防治恶性肿瘤的方法中，NDV一直是一个有吸引力的靶向药物。通过不同的联合机制治疗效果更佳。溶瘤病毒可用于靶向和溶解癌细胞，但提高这种治疗方法的疗效和特异性是一个重大的挑战[34-35]。NDV天然拥有对肿瘤细胞靶向复制能力[36]，其次NDV可激活机体本身的免疫防御系统，加强机体抗肿瘤免疫反应；NDV为负链RNA病毒，不会和宿主基因组发生整合，保证宿主的遗传稳定性[37-38]。但另一方面NDV抗肿瘤研究并不完善，其中包括：实验动物种类和肿瘤模型的局限性；NDV基因组容量小，不利于多个溶瘤基因片段的插入；免疫系统对病毒溶瘤效应的双向调节作用机制有待进一步明确。

溶瘤病毒的研究大多是针对实体肿瘤的治疗，目前NDV对肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、食管癌、口腔磷癌、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、血液恶性肿瘤等癌症溶瘤效果明显[39-50]。随着分子生物学和反向遗传技术的成熟，新城疫病毒抗肿瘤的治疗手段也将更加完善，也将拥有越来越广阔的应用前景。

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(本文责编 陈宏宇)

Progress in Newcastle disease virus against tumor

Beibei Wang, Lili Song, Dehui Ma, Yanxin Dong, and Xueli Wang

Animal Science and Technology College, Inner Mongolia University For the Nationalities, Tongliao 028042, Inner Mongolia, China

Newcastle disease virus is paramyxoviridae, Avian mumps virus genus type I, and infects more than 250 species of birds, causing huge losses on poultry farming worldwide. Numerous experiments have demonstrated that Newcastle disease virus has oncolytic activity on tumor cells and can selectively replicate in cancer cells. Thus, Newcastle disease virus is a potential therapeutic agent for cancer treatment. Some human clinical trials achieved good results. In this review, we summarized research progress of the relationship between the structural protein of Newcastle disease virus and virulence, anti-tumor and autophagy of Newcastle disease.

Newcastle disease virus, oncolytic effect, autophagy, tumor gene therapy

April 23, 2018;

June 12, 2018

Natural Science Foundation of Inner Mongolia, China (No. 2013MS0404).

Xueli Wang. E-mail: wangxl9577@aliyun.com

内蒙古自然科学基金 (No. 2013MS0404) 资助。

2018-07-06

10.13345/j.cjb.180153

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180704.1636.004.html