除草剂阿特拉津对斑马鱼胚胎毒性的研究

郝明娇 王静慧 王 丰 董 武 段莉梅＊

（1.内蒙古民族大学化学化工学院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学动物技术学院，内蒙古 通辽 028000）

0 引言（Introduction）

阿特拉津作为除草剂在农业中广泛使用,是一种三嗪类除草剂[1]。由于其广泛的应用，导致了巨大的生态和人类健康问题[2]。阿特拉津有内分泌干扰毒性，一些研究表明阿特拉津被认为是一种潜在的致癌物质[3]。近年来,阿特拉津因使用量大、残留期长、环境水体中检出率高和具有内分泌干扰作用等而受到广泛关注[4]。

经调查，我国河流，土壤中都发现了有阿特拉津的残留。陶俊[5]等人在低浓度暴露下，阿特拉津对鲫鱼基因组DNA的损伤无明显的剂量-效应关系，阿特拉津毒性在0.375mg·L-1时突然增强，但这一趋势并未向更高浓度组延续 (1.5mg·L-1组表现出的毒性弱于 0.375mg·L-1组和3mg·L-1组 )。

斑马鱼是一种小型的热带淡水鱼，因其产卵量多、早期胚胎发育透明且易于观察、对化学物质有着很强的敏感度，已逐渐成为最有价值实验动物模型。本实验使用斑马鱼作为模型，探讨了除草剂阿特拉津对斑马鱼的毒性，特别是有关形态学以及相关基因的影响。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 仪器与试剂

仪器：电子分析天平（BS2245北京赛多利斯仪器系统有限公司)；5415R型台式离心机(Eppendorf公司)；数码照相机 DXM1200；倒置显微镜 E600，Eclipse Net图像分析软件(Nikon公司)。

药物：阿特拉津为97%原药 (济南科赛基农化工有限公司)；二甲基亚砜溶液等其他药物均来源于美国Sigma公司。

1.2 动物实验以及染毒方法

斑马鱼(Danio rerio,AB 系)，饲养于玻璃容器中，水温 28.5℃，光照周期为 14h·d-1。实验前一天晚上，分别取4条雌鱼和8条雄鱼混养。第二天自然交配后，挑出发育正常的受精卵，受精后4h(4 hour post fertilization，4 hpf)进行暴露实验。实验于直径为 3cm 的六孔板中进行。暴露浓度中均含有20粒胚胎，每组进行3次平行实验。暴露浓度分别为:DMSO(0.1%)对照组，10，20，30，50mg/L的阿特拉津。染毒暴露开始后，将斑马鱼胚胎移入28.5℃孵化箱进行培养。

1.3 形态学观察

斑马鱼胚胎在 4hpf开始染毒，分别在 24，48，72hpf观察和记录死亡率，孵化率和畸形率。

1.4 软骨染色

取72hpf斑马鱼幼鱼，用10%甲醛固定，4℃过夜；Alcian blue 8GR染色，室温过夜；使用95%、90%、80%、70%、50%酒精及蒸馏水各洗30min；用蛋白酶消化 30-60min，0.5%KOH和 H2O2脱色 1h,观察是否已经透明；水洗，70%甘油永久保存。

1.5 数据处理

采用SPSS19.0软件对试验数据进行单因素方差分析及LC50的计算。

2 结果与讨论（Results and Discussion）

图(a)为阿特拉津对斑马鱼死亡率的影响。对照组，10，20，30，50mg/L阿特拉津的死亡率分别为 0%，0%，13.33%，56.67%，100%。 其中 20，30，50mg/L阿特拉津染毒组死亡率与对照组有显著性差异。LC50=28.46mg/L。结果表明，斑马鱼死亡率与阿特拉津染毒浓度呈正相关。

图(b)为阿特拉津对斑马鱼孵化率的影响。对照组，10，20，30，50 mg/L阿特拉津的孵化率分别为 100%，83.3%，73.3%，33.33%，0%。 其中 10，20，30，50mg/L 阿特拉津染毒组,孵化率率与对照组有显著性差异。

图(c)为阿特拉津对斑马鱼脊索弯曲率的影响。对照组，10，20，30，50mg/L 阿特拉津的孵化率分别为0%，0%，20%，66.67%，100%。 其中 20，30，50mg/L阿特拉津染毒组脊索弯曲率与对照组有显著性差异。

通过对除草剂阿特拉津给斑马鱼胚胎染毒，发现了阿特拉津不仅有毒性，可以使斑马鱼脊索弯曲，而且随着浓度的增加可以使斑马鱼致死。使用低浓度的阿特拉津显著抑制了斑马鱼的孵化，这种抑制具有一定的浓度依存性。当阿特拉津的浓度不断增加时，畸形率和死亡率也逐级增加。

本试验说明阿特拉津的致毒致畸性非常严重，作为一种广泛使用的除草剂，我国应该给予足够的重视，同时也说明了斑马鱼作为农药对早期胚胎影响的预警有重要的意义。

3 结论（Conclusions）

（1）阿特拉津对斑马鱼的 LC50=28.46mg/L，斑马鱼死亡率与浓度呈正相关。

（2）阿特拉津会降低斑马鱼得孵化率，并与浓度呈正相关。

（3）阿特拉津会引起斑马鱼特异性脊索弯曲。