基于高通量测序的黄河三角洲4种人工林土壤细菌结构及多样性研究

丁新景,黄雅丽,敬如岩,马风云,*,安 然,田 琪,陈博杰

1 山东农业大学林学院,泰安 271018 2 中国科学院西北生态环境资源研究院 中国科学院寒旱区陆面过程与气候变化重点实验室,兰州 730000 3 中国科学院大学,北京 100049

土壤微生物数量庞大,在生态系统的能量流动和物质循环等生态过程中起着重要的作用,维系着生态系统正常运转,是维护森林生态系统发挥正常生态功能的重要组成部分[1- 2]。土壤微生物的种类组成和群落结构,在很大程度上决定着土壤的生物活性[3]。细菌作为土壤微生物重要的组成部分,具有含氮量高、含碳量低的特点,对土壤养分的形成与分解有促进作用[4- 5]。土壤中的细菌多样性与土壤有机碳、全氮、全磷等含量关系密切,细菌对土壤环境变化敏感,能够在较短的时间内发生大幅度变化[6- 7]。作为土壤质量的重要指标及恢复环境的先锋,细菌提高了生态系统的缓冲能力,细菌多样性指标已经用来评价生态系统中生物群系与恢复功能之间的联系并能为退化土壤恢复提供有用信息[7]。

黄河三角洲地区自20世纪80年代开始大面积营建人工林,主要选用具有耐盐碱、耐干旱特性的刺槐(Robiniapseudoacacia)、榆树(Ulmuspumila)、绒毛白蜡(Fraxinusvelutina)、臭椿(Ailanthusaltissima)等树种,营建的人工林具有抑盐压碱、防风固沙、保持水土、涵养水源、调节气候及改良土壤等重要作用。目前针对该区人工林已经开展了多方面的研究,大多集中于土壤水盐变化[8]、生物群落[9]、土壤养分[10]、土壤生物炭变化[11],但关于土壤细菌群落的研究报道较少。黄河三角洲刺槐、绒毛白蜡、臭椿、榆树4种栽植面积较大,是具有代表性的人工林,本研究采用高通量测序技术研究这4种林分土壤细菌群落结构及多样性,并分析比较黄河三角洲人工林细菌群落差异及其与土壤环境因子关系,可以更好的了解细菌在该类人工林生长中的组成结构,也可为黄河三角洲这类林分中有益菌的筛选和培育及相应菌肥的研制打下基础,并为黄河三角洲人工林的栽培管理及地力维护提供参考。

1 研究地概况

研究地区位于山东省东营市河口区(37°59′14″—37°88′23″N,118°53′27″—118°55′41″E),属暖温带半湿润地区,大陆性季风气候；年均气温为12.3℃,极端最高气温为41.9℃,极端最低气温为-23.3℃,无霜期206 d,≥10℃的积温约4300℃；年平均日照时数为2590—2830 h,太阳辐射年总量5146—5411 MJ/m2；年均降水量为530—630 mm,其中70%分布在夏季,且多暴雨,易形成旱、涝灾害；平均蒸散量为750—2400 mm。地下水位约1.5 m,水质矿化度较高[12- 13]。

人工林为1985年营建,人工林株行距为3 m×3 m。栽植树种主要有刺槐、榆树、白蜡、臭椿、杨树(Populs)、国槐(Sophorajaponica)、苦楝(Meliaazedarach)、柽柳(Tamarixchinensis) 林等。林下生长有茅草(Imperatacylindica)、荻(Triarrhercasaccharifora)、牵牛(Pharbitisnil)等草本植物。

2 材料及方法

2.1 样品采集

2014年11月在刺槐(CH)、榆树(YS)、白蜡(BL)、臭椿(CC)4种人工林中分别设置3个标准地,标准地大小为20 m×20 m,共12个标准地。每个标准地内以梅花形采样法分别设置5个样点,在每个采样点去除地表植被和枯枝落叶后采集0—20 cm土层的土壤,将每个标准地获取大约等量的土壤分别混匀。实验共采集12份土样,液氮保存带回实验室。用于测定细菌多样性的土壤于-70℃条件下保存备用；用于理化性质测定的土样,作风干过筛处理,并用环刀法取样用于测定土壤含水量。

2.2 土壤理化性质测定

土壤电导率采用电导法测定(水土比为1∶5)；土样pH的测定采用电位法(水土比为1∶2.5)；用环刀法测土壤含水量；速效氮的测定采用碱解扩散法；速效磷的测定采用浸提钼锑抗比色法；速效钾含量测定采用火焰光度法；用重铬酸钾氧化-外加热法测有机质。

2.3 土壤微生物DNA提取、测序、处理

采用 Powersoil DNA Isolation Kit(MoBio, USA)提取土壤总DNA[14],经紫外分光光度计测定其浓度和纯度后,再用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的完整性,最后置于-20℃冰箱中保存备用。采用16S V4区引物515F-806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S V4高变区片段进行扩增,PCR条件如下：98℃预变性30 s,98℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸30 s循环27次,最后72℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后4℃保存备用。用New England Biolabs公司的NEB Next® UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建,构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后,使用MiSeq进行上机测序。

IlluminaMiSeq测序平台得到的下机数据(Raw Data)存在一定低质量数据,会干扰分析结果,因此在进行下一步分析前,根据Barcode序列将下机数据拆分为不同的样品数据,截去Barcode序列和PCR扩增引物序列；将拆分的数据使用FLASH对每个样品的reads进行拼接,得到的拼接序列为原始Tags数据(Raw Tags)；Raw Tags经过更严格过滤处理后[15],得到高质量的Tags数据(Clean Tags):Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为3)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；Tags经过截取后得到的Tags数据集,进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags[16]。经过以上处理后得到的Tags序列与数据库(UCHIME Algorithm)进行比对[17],检测嵌合体序列并最终去除其中的嵌合体序列[18]。

2.4 物种注释与丰度计算

利用Uparse软件将所有样品的全部Effective Tags序列聚类分析[19],默认97%的一致性将序列聚类成为OTUs,Uparse构建OTUs时选取具有代表性序列(依据其算法原则,筛选的是OTUs中出现频数最高的序列),将代表性序列集合用RDP Classifier与GreenGene数据库进行物种注释分析。结合物种组成信息结果,得到每个物种在样品中的丰度。

2.5 多样性计算

根据每个样本文库的OTUs丰度信息,利用QIIME(Version1.7.0)软件计算样品的多样性值,包括物种数、Chao1指数、Shannon指数[20]。应用 SPSS 22.0软件分析细菌丰度差异,各处理间数据采用方差分析(ANOVA),以Duncan 法检测差异显著性,显著差异水平P<0.05,极显著差异水平P<0.01。

图1 细菌稀释曲线分析

3 结果与分析

3.1 测序数据分析

从黄河三角洲臭椿、榆树、白蜡、刺槐4种人工林土壤中分别获得31281、55702、23281、26316条原始序列,其中有效序列分别为30964、54236、23146、25949条。对获得的有效序列进行随机抽样,以抽到的序列数与其所代表的OTU数目构建稀释性曲线,如图1。从图中得知,4种人工林土壤样品的稀释性曲线均趋于平坦,表明测序数据合理,更多的测序数据对发现新的OTU贡献率较小。

3.2 人工林土壤细菌群落结构

在相似水平为97%的条件下,与Gold database数据库对比,对所得序列进行聚类分析,结果见图2。结果表明,4种人工林土壤细菌共有31门,其中刺槐、榆树、白蜡、臭椿人工林土壤中分别有24、28、25、26门细菌。4种人工林土壤中酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)细菌以及刺槐、臭椿人工林土壤中的硝化螺旋菌门细菌相对丰度均超过10%,是人工林土壤中的优势群落；另外硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮游菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)5门细菌在人工林土壤中相对丰度超过1%,是土壤中的主要细菌群落。榆树、白蜡人工林土壤中酸杆菌门细菌丰度最高,分别为41.56%、49.20%,显著高于刺槐、臭椿人工林土壤中酸杆菌门细菌丰度(P<0.05)。在刺槐、臭椿人工林土壤中变形菌门细菌丰度最高,分别为29.92%、35.28%。除酸杆菌门、变形菌门细菌外,硝化螺旋菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、泉古菌门(Crenarchaeota)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)6门细菌在4种人工林土壤中丰度差异显著。WPS-2、NC10细菌为榆树人工林土壤特有细菌。

3.3 人工林土壤细菌多样性

4种人工林土壤细菌多样性分析结果见表1。刺槐人工林土壤细菌多样性显著高于其他3种人工林,物种数、Chao1指数、Shannon指数分别为1769.55、2526.61、8.75。榆树、臭椿人工林土壤细菌多样性显著高于白蜡人工林,榆树、臭椿人工林之间土壤细菌多样性差异不显著。4种人工林中白蜡人工林土壤细菌多样性最低,物种数、Chao1指数、Shannon指数分别为1571.47、1824.20、8.35,显著低于其他3种人工林。

3.4 人工林土壤理化性质

不同人工林土壤理化性质见表2。4种人工林土壤电导率介于128.71—138.54 us/cm；人工林土壤为碱性(pH均大于8.3),臭椿人工林土壤pH值最高,显著高于其他3种人工林。刺槐人工林土壤有效磷含量显著高于其他3种人工林,为3.47 mg/kg；榆树、白蜡、臭椿人工林有效磷含量分别是刺槐人工林的33.72%、39.48%、43.52%。榆树人工林土壤碱解氮、有效磷、速效钾、有机质含量均显著低于其他3种人工林。4种人工林中臭椿人工林土壤含水量、速效钾、碱解氮、有机质含量最高,其中臭椿人工林土壤含水量、有机质含量显著高于其他3种人工林；刺槐、榆树、白蜡人工林土壤含水量分别是臭椿人工林的57.56%、51.22%、48.47%,有机质含量分别是臭椿人工林的45.54%、32.65%、49.33%。

表1 人工林细菌群落多样性分析

CC,臭椿人工林,A.altissimaplatations；YS,榆树人工林,U.pumilaplatations；BL,白蜡人工林,F.velutinaplatations；CH,刺槐人工林,R.pseudoacaciaplatations;同列不同小写字母表示在0. 05水平差异显著

表2 不同人工林土壤理化性质

3.5 细菌群落与土壤理化性质

分析表3得知,细菌物种数与土壤有效磷含量呈极显著正相关关系,与速效钾含量呈显著负相关关系；Chao1指数与pH、有效磷含量呈显著正相关关系；Shannon指数与土壤电导率呈显著负相关关系,与土壤含水量、有效磷含量呈显著正相关关系,与pH呈极显著正相关关系。

土壤电导率与酸杆菌门、浮游菌门细菌丰度呈显著正相关关系,与硝化螺旋菌门细菌丰度呈极显著负相关关系,与芽单胞菌门细菌丰度呈显著负相关关系。土壤pH与变形菌门、硝化螺旋菌门、芽单胞菌门细菌丰度呈极显著正相关关系,与酸杆菌门细菌丰度呈极显著负相关关系。土壤含水量与酸杆菌门、绿弯菌门细菌丰度呈显著负相关关系；有机质含量与酸杆菌门细菌丰度呈显著负相关关系；土壤含水量、有机质含量与变形菌门、硝化螺旋菌门、芽单胞菌门细菌丰度呈显著正相关关系。有效磷含量与放线菌门细菌丰度呈显著正相关关系。

表3 细菌群落与土壤理化性质相关关系

*与** 分别表示达到5%和1%的显著水平

4 讨论

土壤环境是植物-土壤-土壤生物组成的特殊微环境。鉴于土壤细菌群落结构及多样性在生态系统中的重要意义,细菌结构及多样性研究逐渐受到关注。由于土壤细菌群落结构复杂、数量巨大以及传统研究方法技术的限制,对细菌群落的了解不够深入。近几年发展的高通量测序技术有助于高效、全面的认识土壤微生物群落。黄河三角洲人工林经过三十多年生长,其根系分泌物、凋落物以及组织渗滤液多年输入土壤,必然深刻改变着人工林土壤理化性质和微生物群落结构。探索不同人工林土壤细菌群落及多样性差异,对于黄河三角洲地区人工林营建及管理具有重要意义。

4.1 土壤细菌群落与植被类型

植被类型和土壤细菌群落之间相互影响、相互适应。土壤细菌群落类型和结构因植被不同存在差异,细菌在土壤中的分布也和细菌的生态幅有关。例如许多研究表明酸杆菌门、变形菌门、放线菌门细菌是不同植被土壤中的优势群落[5, 19- 20],王伏伟等、杨菁等研究表明变形菌门、酸杆菌门、放线菌门细菌分别是麦田、不同降香黄檀混交林土壤中的优势群落[5,21]。本研究也显示酸杆菌门、变形菌门、放线菌门细菌是黄河三角洲4种人工林土壤中优势群落。这应该与酸杆菌门、变形菌门、放线菌门3门细菌的生态幅较宽,其分布受环境影响较小有关,植被类型的改变对土壤中酸杆菌门、变形菌门、放线菌门3门细菌的影响较小,所以这3门细菌在不同植被土壤中均表现为优势群落[22- 23]。

不同树种组成的植被,影响着土壤中的细菌结构和多样性。本研究显示黄河三角洲4种人工林土壤细菌结构、多样性存在一定差异。如刺槐人工林土壤细菌多样性显著高于其他3种人工林；酸杆菌门、变形菌门、硝化螺旋菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、广古菌门、泉古菌门、蓝藻菌门细菌在4种人工林土壤中丰度差异显著。杨菁等关于4种降香黄檀混交林土壤细菌多样性研究发现降香黄檀母生混交林土壤细菌多样性显著低于其他混交林,刘秉儒等研究表明地上植被类型影响土壤中细菌群落结构及丰度[5, 24]。作为土壤中细菌营养物质的主要来源,人工林凋落物以及根系分泌物种类、数量存在差异,特别是不同树木根系分泌物中的类黄酮、酚类化合物、柠檬酸、苹果酸、草酸、阿魏酸、氢氰酸、苯甲酸、肉桂酸、皂角苷等成分差异较大,另外不同树木根系生长代谢及凋落物基质质量也存在不同,根系代谢及凋落物分解会影响人工林土壤的透气性、含水量、pH、土壤颗粒大小、土壤紧实度及土壤中N、P、K、有机质含量等理化性质,细菌群落从土壤中获得的营养物质及其土壤生存环境存在差异,因此地上植被类型能够通过凋落物、根系分泌物在一定程度上影响土壤细菌群落,即植物对细菌群落具有一定的选择作用[24]。

4.2 细菌群落与土壤理化性质

土壤特性差异对细菌种类及组成具有一定影响。其中土壤pH能够直接或间接影响土壤细菌群落结构及多样性,pH能够以直接影响土壤细菌生理代谢、改变微生物群落间竞争关系或抑制非适应性微生物生长等方式,改变土壤细菌群落[25]。有研究表明酸杆菌门细菌在不同pH土壤中相对丰度不同[20,26]。如隋心等研究发现在三江平原土壤(pH介于5.39—5.85)中酸杆菌门丰度为53%[26]；柳春林等在鼎湖山研究表明森林土壤(pH介于3.00—4.50)中酸杆菌门细菌丰度介于53.3%—67.8%[20]。黄河三角洲4种人工林土壤(pH介于8.35—8.52)中酸杆菌门细菌丰度低于隋心、柳春林等研究结果,介于20.38%—49.20%。有研究表明酸杆菌门细菌在酸性土壤中丰度较高,碱性土壤中较低[20]。黄河三角洲人工林土壤pH与酸杆菌门细菌丰度呈极显著负相关关系。酸杆菌门是嗜酸性细菌,酸性土壤环境有利于酸杆菌门细菌的代谢活动,鼎湖山与三江平原土壤为酸性,适于酸杆菌门细菌的生长,而黄河三角洲土壤为碱性不利于酸杆菌门细菌生长,因此人工林土壤中酸杆菌门细菌丰度较低[20]。另外在碱性土壤环境中酸杆菌门细菌丰度较低,减小了土壤中其他细菌的竞争压力,其他细菌可以从土壤中竞争得到更多的营养物质及其他资源,因此黄河三角洲4种人工林土壤中变形菌门、硝化螺旋菌门、芽单胞菌门3门细菌丰度与土壤pH呈显著正相关[26-27]。

黄河三角洲刺槐、臭椿人工林土壤细菌群落中变形菌门细菌相对丰度最高。变形菌门细菌是土壤环境中的一大类细菌群落,其中部分变形菌门细菌能够利用有机物分解产生的氨气、甲烷等营养物质进行生长代谢活动[28]。4种人工林中臭椿人工林土壤变形菌门细菌相对丰度最高,有机质含量显著高于其他3种人工林；相关性分析表明变形菌门细菌与土壤有机质含量成正比,这与变形菌门细菌利用土壤有机质能力的特性相符,即有机质含量较高的土壤中有利于变形菌门细菌生长[28]。芽单胞菌门细菌(Gemmatimonadetes)在其他地区研究中未发现或者丰度极低,如三江平原小叶章土壤中芽单胞菌门丰度只有1%[5,26]。黄河三角洲4种人工林土壤中芽单胞菌门细菌丰度较高,为4.74%—5.67%,而且研究结果表明芽单胞菌门细菌相对丰度与土壤电导率呈极显著正相关。这可能是因为部分芽单胞菌门细菌具有耐盐或嗜盐的特性,因此适宜在含盐量较高的黄河三角洲土壤中生长,相对丰度较高[29-30]。

黄河三角洲是由黄河携带泥沙长期淤积而形成的滨海冲击平原,土壤含盐量普遍较高,而且土壤肥力较差,土壤中微生物和其他地区土壤相比有较大的差异。土壤微生物是生态系统的重要组成部分,在生态系统中的物质循环等生态过程中发挥着重要的生态功能。在黄河三角洲人工林营建过程中如何管理好这一生态系统,使其能够稳定、健康的生长,发挥其改善生态环境的作用,清楚认识人工林土壤中的微生物差异和特性并在管理中加以人工调控就显得非常重要。由于黄河三角洲土壤盐碱含量高,适合在这一地区生长的乔木树种较少,选择黄河三角洲常见的4种较耐盐碱树种营建的人工林,利用目前较为先进的高通量技术对其细菌群落结构和多样性进行研究,进一步了解在这一特殊区域营建的人工林土壤细菌的特性,为在人工林的精细管理中土壤微生物的调控及将来微生物肥料的制备提供一定参考依据。本研究主要对4种人工林从门水平上对土壤细菌多样性特征进行了研究,随着研究的进一步深入,还需要更精确地对土壤中细菌从纲、科、属、种等不同水平进行更为深入的研究,为人工林的精细化管理奠定基础。