SDS-PAGE法分析不同加工方法对鸡蛋蛋白质组成的影响

曹金虎，王令冉，罗静波，俞海东，韩荣勋

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州434025)

禽蛋类是我国人民膳食蛋白质的重要来源。其中，鸡蛋的蛋白质生理价值最高，也是人们日常食用最多的蛋类。鸡蛋的蛋白质生理价值高达94，而牛奶、牛肉、猪肉分别为85、76和74。鸡蛋的蛋清由约87%的水、11%的蛋白质、微量的脂质以及少量的矿物质和维生素等组成；而蛋黄由约51%的水、31%的脂肪、17%的蛋白质、少量矿物质以及多种维生素等组成[1]。然而，不同的加工方法会导致鸡蛋中的蛋白质发生各种不同的改变。

目前我国蛋类制品主要有松花蛋、咸蛋、香卤蛋、茶叶蛋、熏蛋、卤鸡蛋等传统加工蛋制品[2]。其中松花蛋和咸蛋在我国的加工历史已有600余年。20世纪90年代末期开始，蛋类产品的二次加工有了一定程度的发展。如1998年胡久莉等[3]研究了烤蛋的制作方法。同年，周大伟[4]对五香熏蛋的制作方法进行了介绍。2000年马俪珍等[5]对咸金蛋(咸鸡蛋)的加工工艺进行了研究，2001年彭艳等[6]研制出速冻食品-甜蛋，吴红梅等[7]对五香熏蛋的制作方法进行了改进，岳国璋等[8]对无铅鸡蛋皮蛋的加工技术进行了研究。而到了近几年，魏明英等[9]研制出茶叶鸡蛋干，2017年王秀娟[10]对酱卤鸡蛋工艺进行了研究。这些研究将重点放在鸡蛋制品的加工工艺和产品的色、香、味等产品外观和口感质量方面，但并未关注这些蛋类制品在加工前后的蛋白质组成变化。到目前为止，对鸡蛋蛋白质组成方面的研究主要集中在加工对鸡蛋中致敏性物质的免疫反应性和加工过程中蛋白质凝胶特性的变化[11,12]，或是以蛋白组学方法分析鸡蛋中各组分的蛋白质组成等方面的研究[13～16]。

本研究采用SDS-PAGE电泳法比较分析煮鸡蛋、茶叶蛋、熟咸鸡蛋、盐焗鸡蛋、卤鸡蛋及生鲜鸡蛋的蛋白质组成，从而观察鸡蛋蛋白质组成在采用不同加工方法进行加工后所发生的变化，以期为实验室检测鸡蛋全蛋制品是否存在掺假及是否以次充好提供科学数据，也为人们选择更容易消化吸收的鸡蛋制品提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品的采集和准备

实验样品为从市场购买的生鲜鸡蛋、煮鸡蛋、茶叶蛋、咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋。样品在实验前去壳后加入适量超纯水用匀浆机将全蛋搅拌均匀制成全蛋混合物。将100μL全蛋混合物样品分别与等体积的裂解缓冲液(0.3%SDS、3%DTT、蛋白酶抑制剂和0.5mol/LTris/HCl，pH8.0)充分混合后在低温条件下对样品进行超声波粉碎处理。在室温条件下反应1h后，在4℃、12000r/min条件下离心20min去除沉淀物。取上清液，以1mg/mL牛血清白蛋白溶液作为标准溶液，采用Bradford法测定蛋白浓度后分装成每管120μg样品并保存于-70℃冰箱中。

1.2 SDS-PAGE分析

本研究中SDS-PAGE分别采用8%和12%的分离胶[1.5mol/L Tris(pH8.8)、40%Acry/Bis(29∶1)、蒸馏水、10% SDS、10% APS、TEMED]，并采用同等蛋白质含量的上样方法，上样顺序为Marker、120μg生鲜鸡蛋、120μg煮鸡蛋、120μg茶叶蛋、120μg咸鸡蛋、120μg盐焗鸡蛋和120μg卤鸡蛋,在100V电压条件下进行分离。

电泳结束后取出凝胶，经超纯水漂洗后将凝胶放入固定液[30%(体积比)甲醇、10%(体积比)醋酸]中固定，1h后取出凝胶放入考马斯亮蓝R-250染色液中染色24h。染色结束后用脱色液(1%醋酸)脱色后进行图像采集。

2 结果与分析

将相同蛋白质质量的生鲜鸡蛋、煮鸡蛋、茶叶蛋、咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋全蛋蛋白在相同电泳条件下分别用8%、12%的分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，所得的电泳图谱分别见图1和图2。

M:标准蛋白；1:生鲜鸡蛋；2：煮鸡蛋；3:茶叶蛋；4:咸鸡蛋；5:盐焗鸡蛋；6:卤鸡蛋 图1 用8%分离胶分离所得生鲜鸡蛋、煮鸡蛋、茶叶蛋、咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋全蛋蛋白电泳图谱

M:标准蛋白；1:生鲜鸡蛋；2：煮鸡蛋；3:茶叶蛋；4:咸鸡蛋；5:盐焗鸡蛋；6:卤鸡蛋 图2 12%分离胶生鸡蛋、煮鸡蛋、茶叶蛋、咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋全蛋蛋白电泳图谱

由图1可以看出，在8%的分离胶中生鲜鸡蛋分别在200、100、60、40ku和20ku附近存在明显的条带，而煮鸡蛋和茶叶蛋分别在120ku和85ku附近存在模糊的条带，在70ku和60ku以下存在1条条带，在40ku附近存在1条模糊的蛋白质条带。咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋虽然同样在70ku以下存在1条蛋白质条带，而60ku附近只显示模糊的条带，在60ku以下不存在任何蛋白质条带。

由图2可以看出，在12%的分离胶中生鲜鸡蛋分别在200、100、60、50ku和30ku附近存在明显的条带，煮鸡蛋、茶叶蛋、咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋在85ku附近存在1条模糊的条带，煮鸡蛋在70、60ku以下和40ku附近各存在1条条带。而茶叶蛋中这几条条带相对于煮鸡蛋颜色淡了很多，在40ku附近只能观察到1条模糊的蛋白质条带。只有煮鸡蛋和茶叶蛋在30ku附近存在模糊的蛋白质条带，而咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋在30ku附近不存在任何蛋白质条带。咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋虽然同样在70ku以下存在1条蛋白质条带，但是这些条带都相较于煮鸡蛋而言淡了很多，而在60ku附近只显示模糊的条带，在60～20ku之间不存在任何蛋白质条带。在12%的分离胶中，煮鸡蛋、茶叶蛋、咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋在20ku以下存在1条非常明显的蛋白质条带，而在生鲜鸡蛋中观察不到这一条带，并且所有样品在8%分离胶中都观察不到这一条带，形成了鲜明的对比。总体来说，经过加工后，鸡蛋中20ku以上的蛋白质条带基本全部变淡，只在12%分离胶的20ku以下才存在1条非常明显的蛋白质条带。

3 讨论与结论

为了探讨加工后鸡蛋的蛋白质组成变化，本研究采用SDS-PAGE法比较分析了生鲜鸡蛋、煮鸡蛋、茶叶蛋、咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋全蛋蛋白主要蛋白质组成。结果表明，加工后的鸡蛋制品的蛋白质组成与未加工的生鲜鸡蛋蛋白质组成之间表现出了显著差异。在8%分离胶凝胶电泳图谱中能观察到生鲜鸡蛋有19条蛋白质条带，而加工后的各种鸡蛋制品中的蛋白质条带数量显著减少。如煮鸡蛋和茶叶蛋只有4条蛋白质条带，而咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋只有3条蛋白质条带。同样，在12%分离胶凝胶电泳图谱中能观察到生鲜鸡蛋有16条蛋白质条带，而加工后的煮鸡蛋和茶叶蛋只有6条蛋白质条带，咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋只有4条蛋白质条带，并且大部分蛋白质都集中在20 ku以下的小分子量部分。12%分离胶由于较小的孔径，其分离蛋白质的速度较慢，在相同的电压和分离时间下小分子量蛋白质相对于8%的分离胶移动速度较慢。所以在相同的电泳条件下，在12%分离胶中能观察到小分子量蛋白质条带，而在8%分离胶中观察不到这些小分子量蛋白质条带。

本研究结果可为鸡蛋的真伪鉴别提供参考。已报道的有关真假鸡蛋鉴别的相关研究中，杨国武等[17]用双向电泳方法分析了18个市售鸡蛋的蛋白图谱，并获得了与真鸡蛋的蛋黄蛋白质共有的17个蛋白质点，但并未对这些蛋白点进行进一步的鉴定。有关加工条件对鸡蛋蛋白质组成影响的研究中，杨元元[11]对不同加工条件对卵白蛋白免疫反应性的影响研究中，发现湿热60℃、湿热100℃、干热100℃、干热150℃、高温灭菌处理卵白蛋白样品溶液对卵白蛋白的一级结构并无影响。吴序栎等[18]在进行鸡蛋过敏原分离、鉴定与纯化的研究时发现蛋清与蛋黄蛋白粗提液按照每孔10μL上样后蛋黄粗提液的主要蛋白质条带有6条；蛋清粗提液的主要蛋白质条带有5条。而在本研究中，生鲜鸡蛋中能观察到将近20条蛋白质条带。这可能与电泳时全蛋蛋白先用蛋白提取试剂盒提取蛋白质后再定量而且每个样品上样量均为120μg有关。而吴序栎等[18]用蛋清与磷酸盐缓冲液以1∶10的体积比混合后取10μL上样，根据参考文献推测其样品上样量大致为100μg。因此，不同蛋白质提取方式和不同上样量可能是造成最终观察到的蛋白质条带数量不同的原因。

到目前为止，有关煮鸡蛋、茶叶蛋、咸鸡蛋、盐焗鸡蛋和卤鸡蛋全蛋蛋白与生鲜鸡蛋全蛋蛋白比较的研究鲜有报道。本研究采用SDS-PAGE法比较分析了生鲜鸡蛋和这些鸡蛋加工产品的全蛋蛋白质，揭示了鸡蛋加工前后蛋白质组成的变化以及不同加工方法对鸡蛋蛋白质组成变化的影响。本研究所获得的结果对于实验室检测鸡蛋全蛋制品是否掺假及是否以次充好提供了科学数据，也为消费者选择更容易消化吸收的鸡蛋制品提供了参考。本研究采用的是比较简便的SDS-PAGE法，所以只能观察到不同加工方法导致的蛋白质组分差异，要了解有表达差异的蛋白质条带的具体信息还需要进行进一步的分析鉴定。