LC-MS测定结直肠癌患者血浆中5-氟尿嘧啶浓度

涂碎萍，李 获*，陈 岷，张丽娟，钟 磊，陈 璐

0 引言

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在西方国家其发病率居癌症第2位，中国其发病率居第4位[1]。5-FU作为治疗结直肠癌的基础药物[2-5]，约80%在肝脏代谢为非活性产物，受个体差异影响较大[6-7]。有研究表明，部分患者5-FU的药物暴露存在100倍甚至更高的差异[8-10]。此外，Kline等[11-14]研究表明，5-FU血药浓度与药物不良反应及疗效相关，通过监测患者血药浓度，调整用量，可以获得更好的治疗效果。但在临床长期治疗药物监测中发现，传统HPLC分析方法既易受临床治疗周期、合并用药、疾病状态等因素影响，同时又易受内源物质干扰且灵敏度低[15]。因此，本研究旨在通过建立一个快速、简便、灵敏且适用于长期检测5-FU血药浓度的分析方法，用于检测晚期结直肠癌患者的5-FU血药浓度，以提高5-FU临床使用的安全性与有效性。

1 材料

1.1 仪器与试剂 Waters ZQ2000-LC-MS 分析仪(美国Waters 公司)、BP211D电子天平(德国Sartoriμs公司)、优普UPR-II-5T超纯水器(成都超纯科技有限公司)、电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、高速离心机HC-2518(安徽中科中佳科学仪器有限公司)、氮气吹干仪、超低温保存箱；5-氟尿嘧啶(批号：100187-201203，含量≥98%，中国食品药品检定研究院，对照品)、5-溴尿嘧啶(批号：170109-07，含量≥98%，成都普思生物科技有限公司，对照品)、乙酸乙酯(诺尔施，含量99.8%)、甲醇(Dikma公司，含量99.9%)。

1.2 临床资料 纳入2017年3-11月在四川省人民医院接受氟尿嘧啶为主治疗的晚期结直肠癌患者，预计生存期≥3个月，纳入34例，共监测72次。

2 实验方法

2.1 色谱条件 采用Dikma-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-去离子水(45∶55)；流速：0.3 ml/min；柱温：35 ℃；进样量为5 μl。

2.2 质谱条件 离子源：电喷雾电离(ESI)，负离子模式(ESI-)选择性离子监测(SIR)检测。毛细管电压：2.14 kV；锥孔电压：22 V；二级锥孔电压：2 V；六级杆透镜电压：0.5 V；ESI源温度：130 ℃；脱溶剂气温度：400 ℃；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔气流量：50 L/h。SIR 检测：5-氟尿嘧啶m/z128.83，5-溴尿嘧啶m/z188.98。

2.3 溶液配制 精密称取5-FU及5-Br对照品适量，以50%甲醇水定容于10 ml容量瓶中，得1 mg/ml 5-FU和5-Br储备液。从储备液中取适量5-FU和5-Br，用50%甲醇水定容于10 ml容量瓶中，得6 μg/ml的5-FU和4 μg/ml的5-Br的工作液，置4 ℃冰箱保存。

2.4 样品处理 取5-FU和5-Br工作液50 μl，加入200 μl血浆，涡旋30 s，加入1 000 μl乙酸乙酯，涡旋3 min，在14 000 r/min离心5 min，取上清液40 ℃氮气挥干，加入200 μl的50%甲醇水复溶，混匀涡旋3 min，在14 000 r/min离心5 min，取上清液进样。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察 分别取空白血浆、5-FU工作液、空白血浆+5-FU、典型患者血浆样品，除空白血浆不加内标外，其余均按“2.4”项下方法处理，进样测定，记录色谱。结果表明，血浆中的内源性物质对测定无干扰，色谱峰型对称，峰宽小于0.5 min，5-FU与5-Br的保留时间分别为9.18、10.3 min，二者分离度良好，所建方法适用于复杂血浆样品中药物的分析，结果如图1。

2.5.2 线性关系考察 取5-FU和内标5-Br的工作液适量，加入200 μl空白血浆，即得浓度为1 000.0、600.0、360.0、216.0、129.6、77.8、46.7、28.0、16.8 ng/ml的血浆样品，按照“2.4”项下方法处理。以5-FU的质量浓度(X)为横坐标、5-FU与内标峰面积之比(Y)为纵坐标进行加权(1/x2)，进行回归分析。得回归方程为Y=1.030 1 X+0.013 2(R2=0.999 2)，表明5-FU在1 000～16.8 ng/ml范围内线性关系良好，定量限为16.8 ng/ml。

2.5.3 精密度与准确度 取5-FU和5-Br的工作液适量，加入200 μl空白血浆，制成低、中、高3个浓度(830、420、52 ng/ml)的血浆样品，按照“2.4”项下方法处理，每个浓度平行制备6 份，进样测定，连续测定3 d。结果日内和日间RSD均<10% (n=6)。见表1。

图1 血浆中5-FU和内标5-Br的典型图谱

注：A.空白血浆，B.0.5 μg/ml 5-FU和0.4 μg/ml 5-Br标液，C.空白血浆中加入5-FU和内标5-Br，D.30号患者血浆，E.28号患者血浆，F.典型MS图

表1 方法的精密度与准确度(n=6)

2.5.4 基质效应与提取回收率 取5-FU和内标5-Br的工作液，加入200 μl空白血浆制成含5-FU质量浓度为52、420、830 ng/ml的低、中、高3个浓度的血浆样品，按照“2.4”项下方法处理，进样测定，得5-FU与内标比值A；分别取6份不同来源的空白血浆200 μl，按照“2.4”项下方法处理，加入5-FU与内标，制成含5-FU质量浓度为52、420、830 ng/ml的低、中、高3个浓度的血浆样品，每个浓度6份，进样测定，得5-FU与内标比值B；取5-FU和5-Br的工作液，加入200 μl的50%甲醇水，制成含5-FU质量浓度为52、420、830 ng/ml的低、中、高3个浓度样品，进样测定，得5-FU与内标比值C；以A/B计算提取回收率，以B/C计算基质效应。结果显示，提取回收率和基质效应分别是93.20%～99.9%、96.20%～102.5%，均符合生物样品分析方法要求。

2.5.5 稳定性考察 取5-FU工作液适量，以50%甲醇水稀释，加入200 μl血浆制成含5-FU质量浓度为52、420、830 ng/ml的低、中、高3个浓度的血浆样品，按照“2.4”项下方法处理，每个浓度平行制备6 份，分别于室温放置1 h、-70 ℃冻存14 d、反复冻融3 次，考察稳定性。结果显示，上述条件下5-FU的RSD均<10% (n=5)。

2.6 统计学方法 稳态血药浓度采用平均值、中位值、标准差进行统计描述，血药浓度和不良反应的关系采用χ2检验。所有统计分析均由SPSS

17.0软件完成。检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 患者信息 本试验纳入34例长期接受以5-FU为主的化疗方案的晚期结直肠癌患者，男24例，女10例；年龄37～73岁，中位年龄57岁；结肠癌9例(26.47%)，直肠癌25例(73.53%)；有1处转移12例(35.29%)，多于1处转移22例(64.71%)；疗效≤6个周期47例(65.27%)，7～12个周期21例(29.17%)，>12个周期4例(5.56%)；合并用药中，基础用药11例，共23例。共监测72次，平均每个患者采血2次。患者化疗期间合并使用了护肝、保肾、止吐、镇痛、抗感染、皮质激素、升白药、中成药物、靶向药物、免疫增强剂等10余类药物，绝大部分患者合并药物超过15种。

3.2 临床血样分析 患者使用5-FU化疗18～30 h后，于凌晨6∶00～7∶00采集患者外周静脉血[6]，低温保护血液样本，1 h内迅速分离，保存于-70 ℃。按照“2.4”项下方法处理，进行测定，得5-FU稳态血药浓度，并计算AUC，其AUC=Css×TCL，Css为5-FU稳态血药浓度，TCL为患者泵注5-FU的时间[13]。将采集的72个血液样本测定的5-FU AUC绘制成直方图，结果如图2。将患者按照AUC大小分为4组，不同AUC与不良反应发生率见表2。

图2 5-FU的AUC直方图

毒性反应≤10(n=10)ⅠⅡⅢ～Ⅳ10～20(n=47)ⅠⅡⅢ～Ⅳ≥20(n=15)ⅠⅡⅢ～ⅣP值骨髓抑制300027.627.66.42033.313.30.122恶心呕吐4060048.946.86.466.72013.3<0.001腹泻00006.42.12000脱发000000006.7手足综合征0002.100000

注：f：检测总次数

34例结直肠癌患者5-FU AUC不呈正态分布，均值与中位值分别是16.5 mg·h/L、15.8 mg·h/L，标准差7.34 mg·h/L，范围在1.6～59.2 mg·h/L，个体间差异较大。按照AUC值大小分3组，≤10 mg·h/组10例(13.9%)，10～20 mg·h/L组47例(65.3%)，≥ 20 mg·h/L组15例(20.8%)，患者5-FU AUC主要集中在10～20 mg·h/L。χ2检验结果显示，各组恶心呕吐发生率差异有统计学意义(P<0.001)，5-FU所致不良反应(恶心呕吐)与5-FU稳态血药浓度具有相关性。Ⅱ级以上骨髓抑制的发生率随着AUC的增加而增高，但骨髓抑制发生率在各组之间差异无统计学意义(P=0.122)。腹泻、脱发及手足综合征等不良反应病例数少，未做统计学分析。

4 讨论

4.1 患者样本选择与保存 二氢嘧啶脱氢酶(DPD)是5-FU分解关键酶，主要存在于肝与外周血单核细胞中，约80% 5-FU经DPD作用分解代谢为非活性产物。全血是检测5-FU浓度最理想的样本，但受外周静脉血中DPD的影响，5-FU在全血中不稳定。且患者血样采集时，受实验条件、临床采血及保存条件等影响，其血液样本是否及时分离，直接影响5-FU在全血中的稳定性。预试验发现，若采集血样在室温下放置超过1 h后再分离血浆，按照“2.4”项下方法处理，进样测定。结果显示，全血中的DPD可迅速将5-FU降解。其降解速度可能与患者DPD酶水平相关。

有研究表明，当血浆置于4 ℃及以下时，降解程度可降至最低[16]。血浆中若无血细胞混杂或分离后立即冷冻，样本可保存数月以上，且5-FU不会发生降解。因此，本试验采集患者样本后，立即置于冰袋保护的低温箱中，与冰袋隔离，防止溶血，并在1 h内分离出血浆，冻存于-70 ℃冰箱。结果表明，采用该方法采集与保存的血样，5-FU血浆浓度未出现降解，其样本稳定性符合要求。

4.2 影响氟尿嘧啶血药浓度监测结果分析 研究表明，AUC的理想值范围是20～25 mg·h/L[17-18]。但本试验结果显示，约80%的患者AUC低于目标值，仅约19%的患者能达到目标范围，只有少部分患者高于警戒值，并且个体间存在较大的药代动力学差异。这与Gamelin等[19]的一项关于转移性结直肠癌患者的随机对照多中心临床研究结果一致。同时，宋卫峰等[20]发现，5-FU给药后的血药浓度与基于体表面积的给药剂量之间无明显相关性(r=0.056，P=0.217)，同时，与5-FU实际持续输注剂量也无相关性(r=0.066，P=0.146)。而目前影响5-FU血药浓度偏低的因素鲜有报道，依据试验研究推测有以下原因。

4.2.1 化疗后患者组织器官的损害 随着化疗周期的增加，抗癌药物在杀灭癌细胞的同时，会对组织器官如骨髓、胃肠道、肝肾功能等有一定的损害，在一定程度上影响药物的体内过程。

4.2.2 静脉泵的使用 患者使用静脉泵化疗时，泵入时间长达48 h，极易出现静脉管的压折和堵塞，从而影响持续给药速率。

4.2.3 化疗中存在大量合并用药 结直肠癌患者在治疗时，合并使用10余类药物，其中可能存在药物的诱导和相互作用，如皮质类激素。随着皮质激素的使用，可诱导肝药酶活性的增强，从而增加了肝脏对5-FU的代谢。

因此，按体表面积给药的方式，无法满足患者对5-FU的实际剂量需求，通过对5-FU治疗药物监测，对其临床剂量进行个体化调整对结直肠癌患者的治疗是至关重要的。

4.3 AUC与毒性反应相关性分析 Ⅱ级以上骨髓抑制的发生率随着AUC增加而升高，但χ2检验结果显示，各组骨髓抑制发生率比较差异无统计学意义(P=0.122)，其原因可能与样本量有关。随着AUC的增加，腹泻、脱发及手足综合征等不良反应发生率呈升高趋势，但病例数少，未做统计学分析。5-FU所致不良反应(恶心呕吐)与5-FU稳态血药浓度呈正相关。说明大部分患者可以通过检测5-FU血药浓度,调整剂量,使5-FU稳态血药浓度维持在一定水平，预防毒性反应。5-FU血药浓度与不良反应(骨髓抑制、腹泻、脱发及手足综合征等)相关性研究，还需进一步扩大样本量。

4.4 LC-MS分析条件的选择

4.4.1 离子模式的选择 实验条件摸索过程中，5-FU和5-Br内标液在正离子模式(ESI+)较ESI-模式响应值更高，但内标5-Br在ESI+模式下存在双峰现象，干扰5-Br的检测，故本实验选择ESI-模式。

4.4.2 样本前处理方法的确立 单纯使用乙腈或甲醇进行血浆样本的蛋白沉淀，会造成检测时5-FU峰型对称性差且存在拖尾现象。而使用乙酸乙酯萃取后挥干复溶的前处理步骤，检测时5-FU峰型对称良好，同时该方法的提取回收率高且操作相对简单，满足对5-FU检测要求。

4.4.3 色谱条件的选择 色谱条件筛选时，笔者比较了乙酸铵-乙腈= 98.2∶1.8[21]、甲醇-0.1%甲酸水溶液=80∶20[15]、甲醇-0.01%乙酸水溶液=35∶65[22]等不同流动相，出现样品分离效果不理想、峰型对称性差、杂质峰多等现象。本实验选择Dikma-C18的长色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，在流动相为甲醇-去离子水(45∶55)、流速为0.3 ml/min、柱温35 ℃的条件下，所测得的5-FU、5-Br在色谱柱上分离度良好、峰型对称性好，且在目标物附近杂质峰少，条件简单，易于推广使用。

本试验方法取血量少，血液样本处理方法简单，杂质分离良好，灵敏度较高，回收率高，适用于用药复杂且接受长期放化疗治疗的结直肠癌患者的5-FU血药浓度检测。