五味子乙素通过Traf6/TAK1信号通路介导人胃癌细胞凋亡

王金桥，邓银芝

0 引言

五味子乙素(Schisandrin B)主要提取于木兰科植物五味子中木质素，前期研究已确认其具有较好的生物活性[1]，主要表现在保肝护肝，有较强抗炎、清除氧自由基、抗疲劳、增强免疫力和抗衰老等作用[2-5]。有报道，五味子乙素还表现出抗肿瘤活性，可以通过抑制上皮间质转化而影响肿瘤细胞的侵袭与迁移，可以调节肿瘤细胞的周期和凋亡而抑制肿瘤细胞，还可以下调cyclin D1 mRNA的表达抑制肿瘤细胞[6-9]。研究表明，五味子乙素可以抑制胃癌细胞的增殖、诱导凋亡，并且可以破坏细胞间和基底膜黏附性及增强肿瘤细胞间的稳定性，起到抑制胃癌细胞转移的能力[10-12]。但是，五味子乙素诱导胃癌细胞凋亡的作用机制尚不清楚。因此，本文以人胃癌细胞HGC27为研究对象，探讨五味子乙素介导HGC27细胞凋亡发生的作用及对Traf6/TAK1信号通路的影响。

1 材料及方法

1.1 药品、主要试剂和仪器 人胃癌HGC27细胞株购自上海素尔生物科技有限公司；五味子乙素(杭州临安天鸿生物科技有限公司，批号：5521-65-6，纯度≥98%)；CCK8试剂盒(美国Sigma公司，批号：WH1199)；Annexin-FITC凋亡试剂盒(广州碧云天生物试剂公司，批号：P0012S-07)；Bax、Bcl-2、Traf6、TAK1、p-TAK1及β-actin抗体购自美国Sigma公司；Victor3 1420 Multilable Counter酶标仪(DX540，美国)；SDS-PAGE凝胶电泳(北京六一仪器厂，型号：DYCZ-24DN)；双色红外激光成像系统(BIO-RAD，美国)。

1.2 细胞培养及分组 HGC27细胞在含有10%胎牛血清的1640培养基中培养，培养条件为5% CO2、37 ℃，每隔2～3 d进行传代培养，接种后24 h取处于对数生长期的细胞用于后续实验。HGC27细胞分为空白对照组(A组)、12 μg/ml五味子乙素组(B组)、24 μg/ml五味子乙素组(C组)及48 μg/ml五味子乙素组(D组)。用二甲基亚砜(DMSO)溶解五味子乙素，冷冻待用。其中A组细胞加入相同体积的培养基，细胞接种24 h后，加入不同浓度的五味子乙素干预细胞，收集细胞用于各项指标检测。

1.3 CCK8法检测细胞增殖抑制率 HGC27细胞接种于96孔板，每组实验设置6个复孔，当药物干预细胞24、48、72 h后，吸去旧培养基，每孔加入10 μl CCK8试剂，于5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养1 h，用酶联免疫分析仪于450 nm处测定各孔的吸光度值。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集经不同浓度处理后的HGC27细胞48 h后，用无菌的PBS清洗细胞2次，2 000 r/min离心5 min后收集细胞，加入1 μl Annexin-FITC混匀后，加入5 μl Propidium Iodide混匀；避光反应5 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 Western blot检测细胞中Bax、Bcl-2、Trfa6、TAK1及p-TAK1蛋白表达水平 HGC27细胞经不同浓度药物处理48 h后，消化收集细胞，提取蛋白并检测蛋白浓度。每孔上样30 μg进行SDS-PAGE垂直电泳，然后电转至NC膜，脱脂奶粉封闭1 h；进行一抗孵育，用TBST洗膜，每10 min清洗1次，共洗3次，将NC膜放入稀释好的Bax、Bcl-2、Trfa6、TAK1及p-TAK1抗体(1∶1 000稀释)中，4 ℃摇动过夜；TBST洗膜后，将NC膜放入辣根过氧化物酶标记的二抗中(1∶3 000)，室温孵育1.5 h；TBST洗膜3次后进行蛋白表达量分析。

2 结果

2.1 五味子乙素对HGC27细胞增殖抑制率的影响 对于同一药物作用时间点，3种剂量的五味子乙素可以显著抑制细胞的增殖，药物干预组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，并且随着药物浓度升高，细胞增殖抑制率增加，表现出剂量依赖性。对于同一组五味子乙素剂量而言，随着药物干预时间的延长，细胞增殖抑制率升高，组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，表现出时间依赖性。见表1。

表1 各组HGC27细胞增殖抑制率比较(%)

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05；与24 h时比较，▽P<0.05；与48 h时比较，▲P<0.05

2.2 五味子乙素对HGC27细胞凋亡率的影响 B组(12.88%±1.23%)、C组(19.62%±1.54%)、D组(38.40%±2.85%)细胞凋亡率显著高于A组(1.60%±0.43%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。药物干预组两两比较，组间差异均有统计学意义(P<0.05)，并且细胞凋亡率随着药物干预浓度的升高而增加，表现出浓度依赖性。见图1。

图1 不同组别间细胞HGC27细胞凋亡情况比较

2.3 五味子乙素对HGC27细胞中凋亡蛋白表达的影响 结果表明，五味子乙素可以诱导促凋亡蛋白Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并且Bax、Bcl-2表达量随着药物干预浓度的升高而发生显著变化(P<0.05)，呈现出浓度依赖性。见图2。

2.4 五味子乙素对HGC27细胞中Traf6/TAK1信号通路的影响 结果表明，五味子乙素可以显著抑制Traf6、p-TAK1蛋白的表达，并且Traf6、p-TAK1蛋白表达量随着药物干预浓度的升高而显著降低(P<0.05)，呈现出浓度依赖性，说明五味子乙素能够显著抑制HGC27细胞中Traf6/TAK1信号通路的活化，起到诱导细胞凋亡的作用。见图3。

图2 不同组别间Bax、Bcl-2蛋白表达水平的比较

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，

△P<0.05

图3 不同组别间Traf6、p-TAK1蛋白表达水平的比较

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，

△P<0.05

3 讨论

五味子乙素是从传统中药五味子中提取的活性物质，早期研究发现，五味子乙素具有抗肿瘤活性[6-9]，对膀胱癌、前列腺癌及乳腺癌等肿瘤具有抑制作用。但是关于五味子乙素对人胃癌细胞的增殖、凋亡等作用及其作用机制尚未得到证实。本研究探讨了五味子乙素对人胃癌HGC27细胞增殖、凋亡的影响及其可能作用的机制，结果表明，不同浓度五味子乙素作用HGC27细胞后，可以显著抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，并且均表现出浓度依赖性，证实五味子乙素能够降低HGC27细胞的存活率，并诱导肿瘤细胞发生凋亡。

生理条件下，细胞的增殖和凋亡保持一种动态平衡，如果这种平衡发生变化，则会引起肿瘤的发生。细胞内相关基因调控细胞凋亡的发生，然而细胞外环境因素通过膜受体介导信号传导，影响细胞内有关基因的表达水平变化来调控细胞凋亡。较多的信号传导通路参与到肿瘤的发生发展中。转录生长因子-β活化激酶1(TAK1)受外界环境因素的变化可以介导细胞信号的传导，多种细胞因子(如IL-1、TGF-β、TLR、CD4及B细胞受体等)介导的信号均可通过活化TAK1传导发挥相应的生物学效应[13]。研究发现，Traf6转基因小鼠中，当Traf6表达水平上升时，可以促进TAK1的磷酸化，进而诱导细胞炎症、凋亡及氧化应激损伤的发生[14]。本实验结果表明，五味子乙素能明显抑制Trfa6/TAK1信号通路的活化，主要是通过降低pTraf6和p-TAK1蛋白的表达，说明五味子乙素可以通过调控Trfa6/TAK1信号通路介导HGC27细胞的凋亡。Bax是一种促凋亡蛋白，而Bcl-2是一种抗凋亡蛋白[15]，二者在细胞凋亡调控过程中起着十分重要的作用。本研究发现，五味子乙素可以明显诱导Bax表达，抑制Bcl-2表达，从而进一步诱导HGC27细胞凋亡。

综上所述，五味子乙素能够明显抑制人胃癌HGC27细胞的增殖，促使其凋亡，其机制可能与五味子乙素抑制Trfa6/TAK1信号通路活化，继而启动细胞凋亡有关。