微小组织石蜡切片制作体会

梁忠泉 ，袁昌隆 ，张宝贺

（解放军原北京军区北戴河疗养院病理科，秦皇岛 066100）

微小组织相对于外科手术标本而言，一般长径小于0.3cm，如纤维支气管镜（纤支镜）、电子纤维胃镜、咽喉镜、肠镜等钳取的组织，以及肺、肝、纵膈、前列腺、睾丸等穿刺吸取的组织，组织大小可为米粒大小、小米粒大小、芝麻大小，甚至为碎小组织，只要肉眼可见，长径小于0.3cm的组织，我们均称为“微小组织”。由于微小组织体积小、质碎、易丢失，包埋时易被熔化的石蜡液冲散、易漂浮，组织不在同一个平面上，切片时多块微小组织不易切全、易将组织切得所剩无几，甚至切完等。由于所获组织大多数很微小，给病理制片带来一定困难，因此，一些病理技术人员进行了有益的探索，提高了制片质量，并提出了“微小组织”的概念。但这个概念比较模糊，需要进一步明确内涵。本文将就“微小组织”的概念及微小组织石蜡切片的制作谈一点体会。

材料与方法

1 微小组织标本来源

微小组织标本均来自我院住院和门诊患者，部分来自外院送检，主要包括内窥镜检查标本如咽喉、支气管、胃肠、膀胱等以及针吸穿刺标本如肺、纵膈、肝脏、肾脏、甲状腺、胰腺、乳腺、前列腺等。

2 试剂与设备

AF固定液（95%酒精90mL，40%甲醛10mL），95%酒精，无水酒精，环保透明脱蜡液（无锡市江原实业技贸总公司生产），石蜡（熔点56～58℃），KH-TS生物组织智能脱水机1台，BMJ-1生物组织包埋机1台，LEICA-RM2135切片机1台，眼科弯镊子等。

3 取材

微小组织送检前用AF液固定，将送检的微小组织用镊子从标本瓶中取出，放在擦镜纸上（擦镜纸用AF液或清水浸湿）。擦镜纸裁剪为4.5cm×3.5cm大小，按四折叠法进行折叠（图1)：按接近对角线方向折叠，但不要对齐，留一定的边缘便于包埋时打开，然后左右向中间折叠，上方向下折叠；折叠时用镊子轻轻压实特别是折痕处。折叠包好后，放入微孔塑料包埋盒中盖好，然后放在生物组织智能脱水机上进行再固定（AF液3h）、脱水(85%酒精1h、95%酒精I 2h、95%酒精Ⅱ 2h、无水酒精I 1h、无水酒精Ⅱ 2h、无水酒精Ⅲ 2h)、透明（环保透明脱蜡液I 1h、环保透明脱蜡液Ⅱ 1h）、浸蜡（蜡I1h、蜡Ⅱ 1.5h、蜡Ⅲ 1h）。若微小组织太小如碎小组织，可滴加伊红以便识别[1]。

图1 微小组织取材的四折叠法。按A、B、C、D的顺序，均沿虚线向箭头方向折叠，然后放入微孔塑料包埋盒E中Fig. 1 Four-step folding of microtissue. The filter paper was folded along the dotted line in the direction of the arrow in the order of A, B, C, D, which then were placed in the microporous embedding box E

4 石蜡包埋

包埋是指微小组织经过浸蜡后，用包埋磨具、塑料包埋盒和熔化的石蜡液将微小组织包埋起来，冷却后形成组织蜡块[2]。方法：打开塑料包埋盒取出擦镜纸包裹的微小组织，置包埋机操作台热台上，左手持眼科弯镊子压住擦镜纸边缘，右手持眼科弯镊子按上述折叠的相反顺序打开擦镜纸（弯镊子应略为加热）（图2），先在包埋模具中注入一半量熔化的蜡液（图3），然后将包埋模具置于冷台上，用略加热的弯镊子将微小组织转移至包埋模具中。多块微小组织要相对集中放置，不能重叠，用加热的弯镊子轻轻按压微小组织使其在同一平面上，加盖塑料包埋盒，表面刚有点蜡膜时立即加注另一半熔化的蜡液（图4）。待蜡液完全凝固后去掉包埋模具，将微小组织四周用废旧手术刀片（大号）修切成四棱台形状（图5），否则切片时易出现蜡带弯曲，蜡带不连续等情况。

图2 包埋时按“四折叠法”的相反方向打开Fig. 2 The fi lter paper was unfolded in the opposite sequence of four-step folding method when embedded

图3 预包埋微小组织。先往包埋模具中加入一半的熔化蜡液，然后放入微小组织Fig. 3 Pre-embed microtissues. Half of melted paraffin was first poured into the mold, and microtissues were then embedded into the melted paraffin

图4 预包埋微小组织。盖塑料包埋盒，加注另一半蜡液。Fig. 4 Pre-embed microtissues. A plastic cassette was placed over the mold and the rest of melted paraffin was poured into the mold

图5 将蜡块修切成四棱台形状Fig. 5 The paraffin block was trimmed into the quadrangular shape

5 切片

微小组织石蜡切片是制作优良切片的关键步骤之一，应把握好以下几点：①切片前应做好准备工作，如切片机上各部位螺旋是否拧紧，切片刀的角度是否合适等。②将包埋好的微小组织蜡块放入冰箱冷冻5min左右或放在冷冻台上冷冻几分钟。③将微小组织蜡块放在切片机的样品夹头内旋紧固定好，调整好蜡块平面，使蜡块切面与切片刀平行，切片刀角度以20～30度为宜。④修切：修切时要手、眼、耳并用，手在转动快进手轮时动作要轻柔，快进速度要缓慢，用力要均匀；眼要始终紧盯蜡块表面，看组织是否露出，是否到达理想切片面；耳要注意听声音，未修切到组织时声音沉闷，当修切到组织时声音清脆，呈“擦、擦、擦”清脆的悦耳声，当微小组织出现理想切面时开始切片。⑤切片：连续切片，转动切片手轮时动作要轻柔，要匀速转动，切片厚度一般为3～4μm。⑥展片与黏附：将蜡带轻轻摊于20%～40%酒精液中（温度43℃左右），选取5～6个切面黏附于载玻片的1/3处，60℃烤片机烤片。⑥其余同常规，HE染色，根据诊断需要可进行特殊染色、免疫组织化学染色等。

结 果

微小组织经以上擦镜纸折叠取材后无遗漏、丢失现象；石蜡包埋组织集中，无漂浮且组织位于同一平面上，组织与组织之间、组织与石蜡之间无裂隙等现象；切片蜡带连续性好，几乎无切过或切少的情况，蜡带平整、笔直、展开良好（图6），无明显皱折，组织相互间距较小（图7），常规HE染色镜下组织结构和细胞形态清晰（图8，9）。

图6 蜡带：经修切的蜡块切片蜡带笔直Fig. 6 Paraffin strip∶ paraffin block was trimmed into straight strip

图7 预包埋技术解决了组织不在一个平面和切不全的问题Fig. 7 Pre-embedding technique solved the problem that multiple microtissues were not in a same plane therefore avoided incomplete sectioning

讨 论

随着医疗技术的不断发展，临床对术前诊断越来越重视，各种内窥镜早已广泛应用于临床，以其定位准确，对人体损伤小，病理诊断准确而经济费用较低等优点，普遍受到临床医生和患者的欢迎[3,4]，通过非手术途径获取组织标本的数量越来越多，微小组织制片的特殊性逐步被病理技术人员所认识。笔者经过多年的研究对微小组织的概念有了新的理解，现总结如下：①从来源看，微小组织不是通过手术切下来的标本，它主要来自内窥镜及穿刺活检，少量来自胸腹水、尿及各种穿刺液以及实验室细胞培养离心沉淀物。②从制片流程看，微小组织需要做一些特殊处理，如取材时要进行标记以免因组织过小而漏掉，包埋时要进行预包埋等。③从大小看，微小组织长径＜0.3cm，长径超过0.3cm的标本可以和普通标本一起无需进行特殊处理。从以上定义可以看出，非手术来源的标本不一定都是微小组织，偶尔有长径大于0.3cm的内窥镜标本或条索状的穿刺标本，不需要做特殊处理，因此不能视作微小组织。

图8 癌组织结构和癌细胞形态清晰HE染色光镜下观察。比例尺，100μmFig. 8 Light microscopic view of HE stained microtissues. The structure and cell morphology of cancer tissue were clear. Scale bar, 100μm

图9 胃体组织结构和癌细胞形态清晰HE染色光镜下观察。比例尺，100μmFig. 9 Light microscopic view of HE stained microtissues of gastric body. The tissue structure and cell morphology were very clear. Scale bar, 100μm

把握好各个制片的关键环节是解决微小组织制片难题的关键。临床送检的微小组织标本必须进行认真的检查与核对，重点看容器上姓名、微小组织来源等信息是否与病理申请单上记载一致，同一患者不同部位的标本是否分容器盛装，标本固定液的量是否足够，是什么固定液，容器是否带盖（如果容器不带盖且是95%酒精固定，一定要将固定液换成AF液或中性福尔马林固定液，因为95%酒精极易挥发）。如不及时取材，将导致微小组织标本干涸，从而造成切片困难，难以诊断。取材时微小组织，碎小组织应全部取材，以免遗漏，影响诊断[5]，较小组织滴加伊红液，便于包埋时识别，夹取组织时特别小心谨慎，以免组织掉落。每取完一次标本后，应彻底清洗镊子，以免发生交叉污染。取材包裹微小组织的材料有小纱布、小纸片、滤纸、棉襟纸、光面白纸和桑皮纸等，我们采用擦镜纸包裹微小组织，由于渗透性好，组织固定、脱水、透明和浸蜡彻底、效果佳。包裹组织时采用上述将擦镜纸用固定液或水浸湿和四折叠法，以及用镊子压实特别是折痕处等方法，保证了组织不会从擦镜纸中“游出”，避免组织丢失和互相污染，从而保证了病理诊断的准确性。

在微小组织包埋方面，我们采用了预包埋技术，即在包埋时先往包埋模具中注入一半的蜡液，置于包埋机冷台上，然后将微小组织转移至包埋模具中，待表面稍有蜡膜时加注另一半蜡液[6]。此方法的优点是：能将多块、大小不一的微小组织较为紧凑的放置于同一平面上，且在注蜡时不会将组织冲散；由于第一次注蜡后包埋模具是置于冷台上，模具底部温度较低，因此会很快形成一层蜡膜；微小组织从擦镜纸包裹中转移至包埋模具中位置易于固定，不会发生漂浮、丢失现象；在转移组织时要特别小心，注意力要集中，以防组织蹦脱。

微小组织切片较为关键，把握不好就会造成组织修切不全、组织切得所剩无几，甚至将组织修切完等现象，特别是年轻的技术人员，由于缺乏经验，易出现以上情况。多年来，我们采用“手、眼、耳并用”的方法，“手”掌握快进的速度，一定要慢进，速度要均匀；“眼”观察组织修切的深度，当蜡块中心轴最大面修切到时即可连续切片，选取好的蜡带黏附于载玻片上，一般选取5～6个切面，这样便于病理医生观察不同切面的组织结构和细胞变化情况；“耳”听声音，判断组织是否已修切到位，采用这种方法切片很好的避免和减少了微小组织切过或切少的概率，从而避免了因切片原因造成漏诊。在捞片时我们在水中加入95%的乙醇使其浓度在20%～40%左右，这样水的表面张力更大，蜡带更易展开，几乎少有皱折。

总之，由于微小组织体积小而显得尤为珍贵，一张优良的切片是诊断的基础，因此病理技术人员必须具备高度的责任感，在平时的工作中要兢兢业业，一丝不苟，绝不可粗枝大叶，草率从事，要不断实践，总结经验，同时要加强学习，要向老同志学，向书本学，有条件的要走出去学，只有不断总结经验和持续的学习，把握好微小组织制片的每一个环节，认真对待每一张切片，把它做成精品，只有这样才能把微小组织石蜡制片做好，才能让病理诊断医师、临床医师和患者满意。