芽孢杆菌源抗菌肽类物质研究进展

龚发源，胡骏鹏，曾雨雷，戴晋军，王玉莲

（1.华中农业大学 国家兽药残留基准实验室（HZAU），国家兽药安全评价实验室，湖北武汉 430070；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003）

20世纪以来，抗生素在防治人类和畜禽细菌性感染等疾病方面发挥了巨大作用，但是随着抗生素特别是广谱抗生素的长期使用或滥用导致的细菌耐药性问题日益严重，世界卫生组织（WHO）称多重耐药性的出现导致人类对于病原微生物的防治力和控制力正在不断下降（Parisien 等，2008）。美国社会感染性疾病研究中心的报告称在2004年公布的关于急性感染性病例的病原菌中有超过70%的细菌对至少一种治疗病原微生物常用的抗生素具有耐药性（Hassan 等，2012），交叉耐药性的问题也导致新型药物开发愈加困难。因此，开发新型、高效、安全的抗微生物药物以应对严重的病原菌感染及病原微生物耐药性的双重压力显得尤为紧迫（Clardy 等，2006），而某些微生物合成的天然抗菌活性物质（抗菌肽）展现出作为替代品的巨大潜力（Cotter 等，2013）。

1 抗菌肽的概念

微生物产生的抗菌肽（AMPs）是一类阳离子或者两性的小分子多肽（＜10 kDa），具有天然抗菌活性，根据其合成途径主要分为核糖体合成抗菌肽和非核糖体合成抗菌肽（Abriouel 等，2011）。其中核糖体合成抗菌活性肽类物质通常称为细菌素，前体在核糖体合成后需要经过转录后修饰才形成有活性的物质；而非核糖体肽则是一种肽类次级代谢产物，多由常见氨基酸、特殊修饰氨基酸组成，主要通过多功能酶复合体系统合成，并进一步被修饰，比如环化、酰基化、杂环化、甲基化和糖基化等，进而形成具有生物活性的分子肽。

目前已经有超过2000余种来源于植物、动物、病毒、细菌和真菌的抗菌肽类物质，抗菌肽较传统抗生素而言，具有副作用小和病原菌产生抗性的几率低等特点。抗菌肽能够作为治疗细菌感染、真菌感染以及寄生虫感染的新型药物，同时某些抗菌肽还具有抗病毒作用（Brogden等，2011）。

2 芽孢杆菌与抗菌肽

芽孢杆菌是一类兼性厌氧或者好氧，革兰氏阳性杆菌的总称，可产芽孢，生理特征多样，广泛分布于植物体表和根系、土壤、空气。大量研究表明芽孢杆菌能够产生多种具有较广抗菌谱的活性物质，这些抗菌物质大多属于多肽类（Sabate 等，2013）。芽孢杆菌产生的抗菌肽具有抑制霉菌等真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的生物活性，部分还具有抗病毒和抗支原体的特性。

芽孢杆菌产生的抗菌肽类物质根据化学结构组成主要分为细菌素、糖肽类、脂肽类和环状肽类。而根据其合成途径则主要被分为多酶复合体系统合成的非核糖体抗菌肽以及核糖体合成的抗菌肽两类，这也是目前对于芽孢杆菌产生的抗菌肽类物质的常见分类方法（Li 等，2012）。

2.1 非核糖体合成抗菌肽 芽孢杆菌产生的抗菌肽如短杆菌肽、杆菌肽、表面活性肽、伊枯草菌素、丰原素等都主要是通过多酶复合体催化氨基酸残基缩合而成，属于非核糖体合成类抗菌肽。这些非核糖体合成抗菌肽形态各异，包括线型、环状等，环状支链上连接羟基、L型氨基酸或者D型氨基酸。同时，前期形成的小分子肽还可能经过N端甲基化、乙酰化等修饰，形成结构相对复杂的活性肽（Hancock等，1999）。目前芽孢杆菌产生的非核糖体合成抗菌肽，根据其具体的结构差异主要分为表面活性肽（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和丰原素（fengycin）三大家族（表 1）。

2.1.1 表面活性肽 表面活性肽家族是目前研究较全面的一类非核糖体合成抗菌肽，枯草芽孢杆菌中首次发现表面活性肽的存在（Arima等，1968），然而目前已报道的包括 surfactins、esperin、linchenysin、pumilacidin等在内约 20种表面活性肽类物质是由多种芽孢杆菌合成。其本质为环状脂肽类物质，基本结构包括一个由七个氨基酸（LLDLLDL）缩合形成的七肽环状内酯，并且连接有一条13～15个碳原子组成的β羟基脂肪酸链（Peypoux等，1999）。除 esperin外，这些脂类肽的3位和6位均是D-亮氨酸，4位为L-天冬氨酸。早期研究认为表面活性肽家族的区别主要在于脂肪酸链的长度，但是最近的研究认为除了脂肪酸链，末端氨基酸残基的不同也可以用于区分家族的同源性（Defaria等，2011）。根据与β羟基脂肪酸链形成内酯环的末端氨基酸不同，目前通常把表面活性肽surfactins分为三大类，即surfactin A、surfactin B、surfactin C，三者末端氨基酸分别为L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸。

表1 芽孢杆菌产生的主要非核糖体合成抗菌肽

表面活性肽家族具有强大的表面活性剂特性，研究发现浓度为20 μmol/L表面活性肽可使水的表面活性张力从72 mN/m降至27 nN/m（Peypoux等，1999）。作为生物表面活性物质，表面活性肽具有双亲性，与化学合成表面活性剂相比具有更高效的活性，能够耐受高温或极性pH，毒性更低且可以自然降解等优点。而且，部分表面活性肽还具有乳化、发泡、抗病毒、抗支原体、抗植物病原性真菌、杀虫及酶抑制等生理特性。Sabate等（2009）发现一种由B.subtilis C4合成的表面活性肽，0.125 mg/mL的浓度能够有效抑制致病性李斯特菌属。此外报道称5%胎牛血清（FCS）中添加25 mmol/L表面活性肽能够抑制Semliki森林病毒（SFV）、单纯孢疹病毒（HSV-1，HSV-2）、水疱性口炎病毒（VSV）、猿猴免疫缺陷病毒（SIV）、猫杯状病毒（FCV）鼠科类脑心肌炎病毒（EMCV）等病毒的生物活性。因此表面活性肽也被作为一种潜在的抗病毒药物。

2.1.2 伊枯草菌素 伊枯草菌素家族主要是一类环状脂肽类抗菌物质，大部分是由枯草芽孢杆菌产生，目前研究已知的主要包括四种伊枯草菌素（iturin A 、C、D、E）、五种芽孢菌霉素和抗霉枯草菌素。伊枯草菌素家族结构特性包括一个固定氨基酸序列（LDDLLDL）以及一条由14～17个碳原子组成的通过β肽键连接在3位碳原子的疏水性β氨基脂肪酸链尾巴（Hourdou等，1989）。Iturin A、iturin D、iturin E三者的主要区别在于固定氨基酸序列中的氨基酸组成的差异，iturin A中一个天冬酰胺或者谷氨酰胺酸残基被天冬氨酸或者谷氨酸取代就是iturin D，被Asp-OCH3或者Glu-OHS取代则是iturin E，而相比于iturin A，iturin C是不具有抗菌活性的（Peypoux等，1999）。而芽孢菌霉素和抗霉枯草菌素与伊枯草菌素结构的主要区别则在于4、5、6、7位氨基酸的组成。早期研究认为伊枯草菌素家族抗菌肽主要来源于枯草芽孢杆菌，然而最近研究发现在其他芽孢杆菌中也发现伊枯草菌素家族类抗菌物质（Yu等，2002）。

伊枯草菌素家族对真菌如霉菌、酵母菌具有良好的抑制作用，对细菌作用较弱（Besson等，1987），对病毒类基本上没有抑制作用。Klich等（1991）使用纸片法研究发现iturin A对于枯青霉菌、鲜绿青霉等真菌的最低抑菌浓度（MIC）低至每个纸片含量4 μg。广泛的抗真菌谱、低毒及低过敏反应、易生物降解等优点使得伊枯草菌素家族作为长效植物生防药物而被广泛研究和应用。对比伊枯草菌素家族结构与功能发现，其结构组成中自由羧基的位点及长度均可影响其生物活性，同时β氨基脂肪酸链中碳原子数目增多也能增强伊枯草菌素的抗菌活性（Besson等，1987）。

2.1.3 丰原素 丰原素家族主要来源于枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等，主要包括fengycin A、B以及其同源化合物如plipastatin。两者的差别在于9位氨基酸，fengycin为L-酪氨酸，而plipastatin则为D-酪氨酸。丰原素家族的结构特征为十肽，其中8个氨基酸组成环状结构，另外两个氨基酸上连接一个β-羟脂肪酸链（一般13～17个碳原子）。氨基酸结构类型为LDLDLDDLLDL，其中L-酪氨酸与L-异亮氨酸形成内酯键而成环（Lin等，2005）。而fengycin A与fengycin B的结构区别主要在于6位氨基酸，fengycin A为D-丙氨酸，fengycin B为D-缬氨酸；此外两者在脂肪酸链的碳原子数目上也存在一定差异。

研究发现丰原素与伊枯草菌素相比具有更强的抗真菌活性，特别是对丝状真菌类，并且它的溶血性更弱（Steller等，1999）。目前丰原素被广泛应用于农业病原性真菌的防治，如禾谷镰刀菌、黄瓜立枯病菌等，同时伊枯草菌素与丰原素联合使用时具有明显的协同作用。

2.1.4 其他非核糖体合成抗菌肽 非核糖体合成抗菌肽除了三大家族外还包括许多其他抗菌肽类物质。比如Hagelin等（2007）报道的从枯草芽孢杆菌发酵物中分离纯化出的maltacines复合物，通过结构初步鉴定其可能是fengycin的同系物，然而后期研究发现两者在N端氨基酸存在明显差别，因此初步认定其为一种新型的非核糖体合成抗菌肽，并且发现其对于真菌具有较强的抑制作用。另外还有亲水性抗菌肽bacilysin，是一种分子量仅有270 Da的二肽，其N端为L-丙氨酸，C端为L-抗荚膜菌素，其中抗荚膜菌素在bacilysin表现抗菌功能时发挥了巨大作用，对多种细菌如金黄色葡萄球菌和真菌有抑制作用（Ozcengiz等，2015）。此外，还有其他非核糖体合成抗菌肽如rhizocticins 、amicoumacins 等（Bai等，2014）。2.2 核糖体合成抗菌肽 芽孢杆菌核糖体合成的抗菌肽通常被统称为细菌素，是自然中广泛存在的一类抗菌活性物质。细菌素一般包括12～50个氨基酸残基，阳离子型，双亲性或者疏水性。与乳酸菌属产生的细菌素相比，芽孢杆菌属产生的细菌素一般具有更宽的抑菌谱，通常对相近种属的细菌抑菌性更强（Wang等，2014）。芽孢杆菌能够产生大量不同化学结构的细菌素及其类似物，例如枯草芽孢杆菌产生的subtilin，凝结芽孢杆菌产生的coagulin，苏云金芽孢杆菌产生的 bacthuricin、thuricin、entomocin及 tochicin，蜡样芽孢杆菌产生的cerecin，地衣芽孢杆菌产生的bacillocin。

细菌素根据芽孢杆菌属前体在核糖体合成后是否经过翻译后修饰可以将其分为Class Ⅰ（modified）和 Class Ⅱ（unmodified）两类，其中第二类又被分为5个亚类。而目前主要根据硫醚键残基的结构特性而将其分为常见羊毛硫抗生素和非常见羊毛硫抗生素两大类。其中，羊毛硫抗生素一般分子量小于5 kD，主要由一些独特氨基酸如脱氢酪氨酸、脱氢丙氨酸、羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等组成，分子内丝氨酸和苏氨酸通常与半胱氨酸巯基脱水形成硫醚键，常见羊毛硫抗生素一般又分为A型和B型两类；非常见羊毛硫抗生素又因其分子量大小、热稳定性等特性不同而分为多个亚类（Bauer等，2005）。

2.2.1 A型羊毛硫抗生素 A型羊毛硫抗生素一般由21～38个氨基酸残基组成，空间结构一般为带状，含有阳离子和疏水肽，分子量小于5 kD，常见的包括subtilin、ericin等。其中subtilin及其衍生物subtilin B是一类由32个氨基酸残基组成的五环羊毛硫抗生素，且结构与细菌素Nisin具有60%以上的序列同源性（Bauer等，2005）。A型羊毛硫抗生素结构中在3位和7位、8位和11位、13位和19位、23位和26位、25位和28位的脱二氧丝氨酸和脱二氧氨基丁酸残基形成硫醚桥梁而构成五个羊毛硫氨酸环，其中第一个和最后一个羊毛硫氨酸环结构域具有双亲性。Fuchs等（2011）分离鉴定了一种来源于Bacillus subtilis DSM15029的同源性抗菌肽，与subtilin在结果上仅仅是6位、15位和24位的氨基酸残基组成不同，其对多种革兰氏阳性菌具有较高的抑制活性，而对于真菌等活性较低；研究发现subtilin及其部分衍生物对产单核细胞李斯特菌属、肉毒杆菌属等食品工业病原菌具有较高的活性，因此也被用作食品防腐剂（Scallan等，2011）。

Ericin属于另一类A型羊毛硫抗生素，其主要来源于Bacillus subtilis A1/3菌株（Stein等，2002）。目前已有两种Ericin被报道，分别为Ericin A 和 Ericin S，分子量为2986 Da和 3442 Da。其中Ericin S更近似于subtilin的衍生物，两者在结构上区别仅仅在6位、15位、24位和29位氨基酸的组成不同。而Ericin A 与Ericin S存在13个氨基酸的差异，同时在羊毛硫氨酸环和C端组成也存在结构差异。Ericin A 和Ericin S抗微生物活性也存在区别，Ericin S 具有和subtilin相似的抗菌谱，主要对革兰氏阳性菌有抑菌活性，而且其抑菌活性约为Ericin A 抑菌活性的100倍左右。

2.2.2 B型羊毛硫抗生素 B型羊毛硫抗生素大多是球形肽类，一般不带电荷或者带负电荷，具有疏水性，常见的如mersacidin，由20个氨基酸残基组成，分子量为1825 Da，在1位和2位、4位和12位、13位和18位、15位和20位形成四个分子内硫醚桥梁而构成球形结构（Szekat等，2003）。Mersacidin能够作用于磷脂lipid Ⅱ而抑制细菌细胞壁的合成，对多种革兰氏阳性菌如链球菌属、葡萄球菌属等具有抗菌活性，研究发现其对耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）具有良好的抑制作用（Kruszewska等，2004）。

2.2.3 非常见羊毛硫抗生素 非常见羊毛硫抗生素主要包括sublancin 和subtilosin A两大类。其中sublancin是一种来源于Bacillus subtilis 168菌株由37个氨基酸残基组成的新型羊毛硫类抗生素，其分子内含有一个β-甲基化羊毛硫氨酸桥连结构，分别为19位和22位之间形成的一个硫醚键以及7位和36位、14位和29位之间形成的两个二硫键，最终构成大环分子结构。其抗菌谱与其他羊毛硫抗生素类似，对革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更有效，抗菌谱主要包括蜡样芽孢杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌等病原菌（Paik 等，1998）。

Subtilosin A也是最初来源于Bacillus subtilis 168或者Bacillus subtilis ATCC6633菌株的由35个氨基酸残基组成的非常见羊毛硫抗生素，分子量为 3399.7 Da，分子内的 4、7、13位半胱氨酸分别与31位的苯丙氨酸、28位的苏氨酸、22位的苯丙氨酸缩合形成连接桥。此外，它在α碳端氨基酸残基缩合构成闭合环状（Thennarasu等，2005）。Subtilosin A抗菌谱更广，对包括产单核细胞李斯特菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等在内的多种病原菌具有抗菌活性。

3 抗菌肽的作用机制

抗菌肽的作用机制主要为细胞膜损伤机制，即大多数阳离子型且具有双亲性或者疏水性的抗菌肽作用于细胞膜靶位点，形成膜孔通道，破坏细菌细胞结构完整性，导致细胞质外泄而杀灭细菌（Huang等，2009）。抗菌肽通过细胞膜损伤机理发挥抗菌作用主要包括三个阶段带正电荷的阳离子型抗菌肽与细菌细胞膜上带负电荷的靶位点结合；形成膜孔通道，破坏细胞膜的完整性；在细菌细胞电动势能作用下，引发细胞内水溶性物质的大量渗出，最终导致细菌死亡。此外，脂肽类抗菌肽的脂肪酸链有利于其发挥抑菌作用，比如伊枯草菌素家族结构中的β-羟基脂肪酸链能够通过重组细胞膜的磷脂双分子层而发挥更好的抑菌活性，特别对于真菌类而言。

抗菌肽还可通过胞内损伤机理发挥作用，即抗菌肽可以直接通过脯氨酸或者精氨酸的铰链区在不改变细胞膜通透性的情况下直接穿过细胞膜，在胞内蓄积后作用于DNA、RNA和蛋白质合成或翻译等阶段，进而抑制膜蛋白合成，破坏细胞膜完整性导致细菌细胞的损伤或者死亡。Lan等（2010）通过体外试验发现抗菌肽Buforin可以在体外与大肠杆菌的DNA和RNA结合而改变它们的电泳迁移率，侧面验证抗菌肽与DNA等作用的可能性。Zhang等（2013）在研究解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens K103 产生的伊枯草菌素样抗菌肽bacillomycin L时发现它除了具有形成细胞膜孔道的机制外还可以作用于真菌的DNA而造成其损伤。

此外，还有一些关于其他作用机制的报道。比如在研究surfactin家族一种新型抗菌肽WH1-fungin时发现其在发挥抑制真菌作用时存在两种不同的现象，高浓度时能够在细胞膜表面形成膜孔；而低浓度时则会诱导细胞的凋亡。同时该抗菌肽能够与线粒体膜上的ATP酶结合而降低其生物活性（Qi等，2010）。Subtilosin作为一种阴离子抗菌肽，其作用机制与众多阳离子抗菌肽存在差异，Noll等（2012）在研究subtilosin时发现其可以结合细菌细胞膜特异性靶位点直接作用于细胞膜，造成跨膜pH梯度发生变化，改变细菌的质子动势而引发胞内ATP外流使细胞死亡。

4 展望

传统饲用或人用抗生素耐药性形势严峻，迫使人们加快寻求抗生素替代品的步伐，无可否认某些天然活性物质如抗菌肽具有潜在的可能性，特别是来源于芽孢杆菌的抗菌肽，因其广谱抗菌能力以及较为高效的活性而备受关注。但是对于源自芽孢杆菌的抗菌肽而言，要真正的进入人类或者畜禽药物等领域却还需要更严谨的理论和实践研究，比如在其作用机制、毒理学、免疫组学等方面。随着一些新技术的出现，对于芽孢杆菌类抗菌肽研究也将日趋深入，特别是借助生物膜系统对其作用机制的研究以及更为有效的评估其细胞毒性作用等，这都会不断加快芽孢杆菌类抗菌肽的研究进展及应用。