肌肽对1型糖尿病大鼠心脏的保护作用*

周 立， 连 辉， 王志勇

(新乡医学院人体解剖学教研室， 河南 新乡 453003)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者发生心肌结构改变和心室舒缩功能异常的特异性心肌病，是患者致死的重要原因之一[1]。大量研究证实，心脏代谢紊乱诱发的氧化应激损伤、炎症、纤维化、微血管病变和凋亡等共同参与DCM的发生发展，其中血糖代谢异常通过晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等通路引起的氧化应激损伤是DCM发生的始动因素，具有抗氧化功能的各种药物在实验模型和临床治疗中已展现出一定的保护作用[1]。缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)在心肌细胞的协同收缩中起着至关重要的作用，糖尿病大鼠心脏PKC通路激活可引起Cx43磷酸化和分布改变[2]。肌肽(carnosine，CAR)是由β-丙氨酸和组氨酸组成的二肽，已被证实具有抗氧化应激、抑炎和神经保护等广泛药理作用[3-5]。肌肽能拮抗高糖诱导的心肌细胞氧化应激损伤和凋亡[6]，但目前尚缺乏组织和器官的相关证据。为此我们以链脲佐菌素(streptozotoein，STZ)诱导的1型糖尿病大鼠为模型，以心功能、心肌氧化应激、炎症和Cx43的表达变化为观察指标，初步探讨肌肽改善1型糖尿病大鼠心功能的机制，为临床糖尿病心肌病的防治提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 动物分组与处理

40只雄性SD大鼠，体质量200～220 g，由新乡医学院实验动物中心提供(合格证号为11400700256933)。将大鼠分成正常对照(control，C)组，CAR对照(control+CAR,C+CAR)组，糖尿病模型(DM)组和糖尿病CAR治疗(DM+CAR)组，每组10只。其中，DM和DM+CAR组禁食12 h后按55 mg/kg 剂量腹腔注射链脲佐菌素，3 d后测空腹尾静脉血血糖≥16.7 mmol/L为成功模型；C+CAR和DM+CAR组腹腔注射CAR (250 mg·kg-1·d-1)，喂养12周。

2 主要试剂

链脲佐菌素(Sigma)；超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成)；兔抗大鼠Cx43、PKCα、PKCβ1、PKCβ2、PKCδ、PKCε和PKCδ抗体(Abcam)；Alexa Fluor 594荧光标记驴抗兔 II 抗(Invitrogen)；化学发光剂和蛋白提取试剂盒(Beyotime)；TRIzol、逆转录和扩增试剂盒(Invitrogen)；其它常用生化试剂均为国产分析纯。

3 主要方法

3.1心功能测定 各组大鼠禁食12 h后，20%乌拉坦(5 mL/kg)腹腔麻醉大鼠并仰卧固定于手术台上。分离颈总动脉并插管至左心室，经BL-420生物信号采集系统获取心率(heart rate，HR)、左心室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)及左心室内压最大上升和下降速率(left ventricular pressure maximum rise/fall velocity，LV±dp/dtmax)。

3.2心脏组织取材及生化指标测定 心功能测量完毕后，麻醉状态下快速取出心脏。切取部分左心室组织，OCT包埋后液氮速冻，用于免疫荧光染色。另取部分左心室组织液氮速冻后置于超低温冰箱保存。心肌组织液氮研磨后冰浴下匀浆，3 500 r/min离心15 min，取上清液备用。参照说明书用ELISA法测定心脏组织中SOD活性和MDA含量。

3.3免疫荧光法检测Cx43表达 取上述液氮冻存的心肌组织用Leica CM1900冰冻切片机切片并贴至载玻片上，片厚7 μm。切片浸入含0.75% Triton的PBS溶液15 min，然后加入10%驴血清室温封闭1 h，滴加兔抗大鼠Cx43抗体，4 ℃过夜，复温后滴加荧光 II 抗，37 ℃温育1 h，PBS漂洗3次，加入抗荧光衰减封片剂封片。荧光显微镜(Nikon E80i)观察并拍摄图像，结果采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件分析。

3.4Western blot检测左心室肌组织Cx43及PKC各亚型的蛋白表达 左心室肌组织用液氮研磨后加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂冰上匀浆，BCA法测定蛋白浓度。制备10%分离和5%浓缩胶，每孔上样量50 μg，凝胶电泳分离后转膜，用封闭液室温封闭1 h，I抗孵育浓度均为1 ∶1 000，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入Alexa Fluor 594标记的驴抗兔IgG (1∶1 000)室温孵育2 h，ECL显色，凝胶图像分析系统扫描定量并分析。

3.5Real-time PCR检测炎症因子mRNA的表达 根据TRIzol试剂盒说明提取左心室肌总RNA。参照逆转录试剂盒说明进行反转录，合成cDNA，再进行PCR扩增。PCR引物由上海生工公司设计并合成。采用两步法和20 μL反应体系在Bio-Rad CFX96荧光定量上扩增。反应条件为94 ℃预变性3 min；95 ℃ 3 s，59 ℃ 20 s，40循环。引物序列及反应产物见表1。待测基因的表达水平通过2-ΔΔCt方法进行计算。

4 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

结 果

1 各组大鼠体重、心脏重量、心脏指数及血糖情况

实验过程中DM和DM+CAR组大鼠各死亡2只，最终有36只大鼠完成实验。DM组和DM+CAR组大鼠消瘦明显，与C组相比，DM组大鼠体重和心脏重量降低，血糖升高(P<0.01)；与DM组比较，DM+CAR组大鼠体重、心脏重量、心脏指数及血糖的差异均无统计学显著性，见表2。

2 各组大鼠心功能的变化

各组大鼠HR的差异无统计学显著性。与C组相比，DM组大鼠的心功能显著降低，表现为LVEDP显著升高和±dp/dtmax显著降低(P<0.01)；肌肽治疗可轻度改善糖尿病大鼠心功能，表现为LVEDP降低，±dp/dtmax升高(P<0.01)，见表3。

表2 各组大鼠体重、心脏重量、心脏指数及血糖比较

**P<0.01vsC group.

表3 肌肽对糖尿病大鼠心功能的影响

**P<0.01vsC group;##P<0.01vsDM group.

3 肌肽对糖尿病大鼠左心室组织SOD活性、MDA含量和炎症因子表达的影响

与C组比较，DM组大鼠左心室组织的SOD活性明显降低(P<0.01)；与DM组比较，DM+CAR组左心室组织的SOD活性升高(P<0.05)。与C组比较，DM组大鼠左心室组织的MDA含量明显升高(P<0.01)；与DM组比较，DM+CAR组左心室组织的MDA含量明显降低(P<0.01)，见图1。

与C组相比，DM组大鼠左心室组织的TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平均显著升高(P<0.01)；与DM组相比，DM+CAR组大鼠左心室组织的TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平显著降低(P<0.01)，见图1。

Figure 1. The effects of carnosine (CAR) on cardiac superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and pro-inflammatory cytokine levels in each group. C: control group； C+CAR: control+carnosine group； DM: diabetes mellitus group; DM+CAR: diabetes mellitus+carnosine group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group.

图1肌肽对糖尿病左心室超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量和炎症因子mRNA表达的影响

4 肌肽对糖尿病大鼠左心室组织Cx43蛋白表达的影响

C组和C+CAR组左心室组织Cx43多呈短杆状和簇状规则分布于闰盘处，与心肌纤维垂直；DM组Cx43在闰盘处分布明显减少，多呈点、片状无规则分布于细胞膜侧面和细胞浆内；与DM组比较，DM+CAR组Cx43的分布明显改善，但闰盘处分布明显不如C组和C+CAR组。应用计算机图像分析检测系统发现，与C组相比，DM组Cx43荧光强度显著降低(P<0.01)，与DM组相比，DM+CAR组Cx43荧光强度显著升高(P<0.01)；与C组相比，DM组Cx43在闰盘处的阳性面积显著降低(P<0.01)，与DM组相比，DM+CAR组Cx43在闰盘处的阳性面积显著升高(P<0.01)，见图2。

Western blot结果显示，与C组相比，DM组磷酸化Cx43蛋白水平明显升高(P<0.01)；与DM组相比，DM+CAR组磷酸化的Cx43蛋白水平显著降低(P<0.01)，见图3。与C组相比，DM组非磷酸化的Cx43蛋白水平显著降低(P<0.01)；与DM组相比，DM+CAR组非磷酸化的Cx43蛋白水平升高(P<0.01)，见图3。结果说明肌肽治疗能明显抑制DM大鼠心肌组织Cx43的磷酸化水平。

5 肌肽对糖尿病大鼠左心室PKC表达的影响

Western blot结果显示，PKCα、PKCβ1、PKCβ2、PKCδ和PKCθ的表达在C组、C+CAR组、DM组和DM+CAR组采用方差分析和两两比较，差异均无统计学显著性。与C组相比，DM组左心室PKCε的表达显著升高(P<0.01)；与DM组比较，DM+CAR组PKCε的表达显著降低(P<0.01)，见图4。结果说明肌肽治疗能明显降低DM大鼠左心室PKCε的表达。

Figure 2. The micrographs of Cx43 and the quantitative analysis of mean intensity and immunoreactive particle area of Cx43 (×40). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsC group;##P<0.01vsDM group.

图2肌肽对糖尿病左心室Cx43表达和分布的影响

讨 论

作为糖尿病患者最常见的心血管并发症，DCM发病机制复杂，目前尚无特异性治疗方法。心肌代谢紊乱诱发的氧化应激损伤被认为是DCM发生的核心环节，抗氧化剂在DCM病人的治疗中被推荐使用[7]。近年来研究显示，炎症也是DCM发病的主要原因之一，氧化应激和炎症反应相互促进，继而引发心功能紊乱[8]。肌肽作为内源性强抗氧化剂，还有抗炎和抗衰老等作用，对糖尿病并发的脑、肾和视网膜损伤有较好的疗效[3-5]。然而，肌肽对糖尿病大鼠心功能的影响及机制并无相关研究。本研究首次对这一问题进行探讨，以期为治疗DCM提供一定的理论和实验依据。

Figure 3. The protein levels of total Cx43 and its functional phosphorylated forms. P0: unphosphorylated form of Cx43; P1 and P2: phosphorylated forms of Cx43. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsC group;##P<0.01vsDM group.

图3肌肽对糖尿病左心室Cx43磷酸化的影响

1型糖尿病并发DCM的机制和治疗研究较少。研究显示1型糖尿病患者在儿童期即出现明显的心舒张功能不全，中年发生心衰的风险大幅增加[9]，与心肌氧化应激损伤存在正相关[10]。左心室+dp/dtmax反映左心室的收缩功能；LVEDP和-dp/dtmax反映左心室的舒张功能。本研究采用左心室插管技术检测到1型糖尿病大鼠模型LVEDP明显升高，±dp/dtmax降低等心功能障碍；ELISA和real-time PCR检测到左心室组织SOD活性降低，MDA含量和炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)mRNA表达水平升高，与何玉莲等[11]和赵云跃等[12]的研究结果类似。在师岩等[6]细胞实验的基础上，本研究进一步发现肌肽治疗12周后，DM组大鼠左心室心功能有所改善，氧化应激和炎症明显降低，与肌肽保护其它器官功能的报道相符[3-5]。

Figure 4. The expression of PKC isoforms in the left ventricular tissue in different groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsC group;##P<0.01vsDM group.

图4肌肽对糖尿病左心室PKC各亚型蛋白表达的影响

Cx43是心室肌中最主要的缝隙连接蛋白，呈簇状或阶梯状排列于相邻细胞连接处和闰盘部位，其组成的低电阻通道是心肌同步收缩和离子交换发生的基础。糖尿病时Cx43的表达和分布发生改变，是DCM心律失常和心功能异常的重要病理基础[2]。PKC是G蛋白偶联受体系统中的效应物，目前已知有12种亚型，受氧化应激、炎症和生长因子等多种因素调节。激活的PKC引起Cx43蛋白Ser368位点磷酸化导致通道解聚，继而引起Cx43的表达和分布改变[13]。临床和基础研究均显示糖尿病患者和动物模型心肌PKC通路激活，但具体亚型尚未有结论[14]。为了进一步探讨肌肽在DCM中的保护机制，我们使用免疫荧光和Western blot检测了肌肽对DM大鼠左心室PKC及Cx43的影响。结果显示，在所检测的PKCα、β1、β2、δ及ε 5种亚型中，DM大鼠PKCε升高，与Lin等[15]的研究结果一致，而Liu等[14]的研究发现PKC的以上几种亚型均有不同程度的升高，可能由于检测的时点不同，心脏处于不同的生理病理状态有关。与C组大鼠比较，DM大鼠左心室Cx43排列紊乱，荧光强度及闰盘处的Cx43面积显著降低，磷酸化的Cx43的表达升高，非磷酸化的表达降低，提示Cx43趋向于降解，心肌细胞之间的电化学信号传导受阻；肌肽治疗后DM大鼠Cx43在闰盘处的表达明显升高，PKCε及磷酸化的Cx43表达显著降低，说明肌肽能改善DM大鼠心肌Cx43的表达及空间分布，进而改善心肌间电化学信号转导。

本研究表明肌肽治疗能改善1型糖尿病大鼠心功能障碍，其机制可能与降低左心室氧化应激和炎症反应，通过PKC通路抑制Cx43磷酸化，并改善其分布有关。综上，本研究为肌肽在DCM中的作用提供了实验依据，提示肌肽具有治疗DCM的潜能，为DCM的临床治疗提供了新的思路，但由于肌肽是一个多靶点药物，是否存在其它保护途径及其机制尚需深入研究。