黄芩苷通过影响miR-141上调Sirt1表达而抑制高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡*

吴 军， 夏瑗瑜， 陈 杰， 肖 玲， 王 优， 赵媛媛， 叶 刚， 尹青桥△

(武汉第三医院 1内分泌科， 2肾内科， 湖北 武汉 430000)

糖尿病是以胰岛素分泌或活性障碍引起的持续性高血糖为特征的一种代谢失调性慢性疾病，并伴有多个器官的功能异常的并发症，其中糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)为其最常见的并发症之一[1]。血液中长期高糖(high glucose，HG)环境可诱导肾小球系膜细胞凋亡，造成的系膜细胞的缺失是糖尿病导致肾损伤的主要病理机制[2]。近期研究发现黄芩中一种黄酮类有效成分黄芩苷(baicalin)具有良好的肾脏保护作用，且在治疗DN中发挥重要作用[3]，然而，黄芩苷治疗DN的作用机制尚未完全阐明。

沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，Sirt1)为第3类组蛋白脱乙酰酶，在许多高糖相关炎症性疾病中是一种关键的调控因子。近年来研究表明，Sirt1可以通过调节高糖环境下肾脏细胞的氧化应激状态，抑制肾脏细胞凋亡和肾脏炎症反应，从而缓解糖尿病肾病的发展[4]。微小RNA(micro-RNA，miRNA，miR)是一种非编码小RNA分子，在多种生理过程中发挥作用，包括细胞分化、增殖和凋亡等[5]。此外，miRNA被广泛认为对多种疾病具有调控作用，包括糖尿病肾病。通过靶基因预测软件(microRNA.org)预测Sirt1存在的miRNA，得到Sirt1的3’非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)含有miR-141的结合位点。因此，本研究拟通过研究黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞内miR-141及其靶基因Sirt1的表达水平及细胞凋亡的影响，深入阐释黄芩苷对糖尿病引发的肾病的治疗机制。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠肾小球系膜细胞系SV40-MES-13购自上海酶联生物科技有限公司。DMEM培养基购自Invitrogen；miR-141 mimic(用于过表达miR-141)、miR-141 inhibitor(用于抑制miR-141表达)、si-Sirt1(用于抑制Sirt1表达)、pcDNA-Sirt1(用于过表达Sirt1)以及各自对照物均购自上海吉玛制药技术有限公司； RNeasy试剂盒购自Qiagen； Reverse Transcription System Kit购自TaKaRa；mirVanaTMRT-qPCR miRNA Detection Kit购自Ambion； BCA蛋白分析试剂盒和细胞溶解缓冲液购自Beyotime。

2 方法

2.1细胞培养、转染与分组 小鼠肾小球系膜细胞系SV40-MES-13接种于含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及1%双抗的DMEM培养基中，并在37 ℃、5% CO2的饱和湿度的培养条件下培养。待细胞融合度达到80%～90%时，根据Lipofectamine 2000试剂说明书，将miR-141 mimic、miR-141 inhibitor、si-Sirt1、pcDNA-Sirt1以及各自对照物转染进细胞。本实验细胞分组如下：正常对照(control)组：培养基中加入5.5 mmol/L葡萄糖；HG组：培养基中加入25 mmol/L葡萄糖；黄芩苷组：培养基中加入100 μmol/L黄芩苷以及5.5 mmol/L葡萄糖；HG+黄芩苷组：培养基中加入100 μmol/L黄芩苷以及25 mmol/L葡萄糖。

2.2miR-141表达水平的检测 采用qPCR检测miR-141表达水平，RNeasy试剂盒提取细胞内总RNA，利用Reverse Transcription System Kit将RNA逆转录合成cDNA,在ABI 7500 PRISM 7500检测系统(Applied Biosystems)里，以cDNA为模板，利用mirVanaTMqRT-PCR miRNA Detection Kit进行qPCR检测miR-141表达水平。每个实验重复3次。所有操作均严格按照试剂盒附带的说明书进行。PCR扩增条件：95 ℃预变性10 min; 95 ℃变性15 s， 60 ℃退火60 s， 72 ℃延伸30 s， 共40个循环。引物序列如下：miR-141上游引物序列为5’-GGGCATCTTCCAGTACAGT-3’，下游引物序列为5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列为5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’，下游引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.3Sirt1蛋白水平的检测 将各组细胞收集后，在细胞溶解缓冲液中置于冰上孵育30 min。细胞裂解液经过离心机12 000 r/min离心5 min，收集上清液用BCA蛋白分析试剂盒检测蛋白浓度。取等量的蛋白样品行10%SDS-PAGE，转至PVDF膜上，后用5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入Ⅰ抗(1∶2 000)在4 ℃孵育过夜。加入Ⅱ抗在室温下孵育1 h。ECL化学发光，采用HRP Developer图像软件显影，利用Laserdensitometer分析软件进行定量分析。

2.4Sirt1与miR-141调控关系的分析 双萤光素酶实验用于检测Sirt1与miR-141的调控关系。通过生物信息学预测工具(http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do)预测出miR-141与Sirt1存在结合位点。将Sirt1野生型片段和突变型片段(miR-141与Sirt1的结合位点已被突变)克隆至pmirGLO双萤光素酶报告质粒上，重组报告质粒分别命名为pmirGLO-Sirt1-WT和pmirGLO-Sirt1-MUT。将重组报告质粒分别与miR-141 inhibitor或miR-141 mimic共转染至SV40-MES-13细胞中。转染24 h后，收集细胞利用双萤光素酶基因报告系统检测各组萤光素酶相对活性，再将数据进行统计与分析。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡 细胞培养48 h后，通过500～1 000 r/min离心5 min，收集细胞。PBS清洗后，加入Annexin V-FITC和PI染液，4 ℃避光染色5 min。在FACSVerse流式细胞仪(Becton-Dickinson)通过荧光激活细胞分选仪检测细胞凋亡水平。

3 统计学处理

利用SPSS 17.0统计软件进行数据处理和统计分析。所有实验都重复3次，采用均数±标准差(mean±SD)来表示所有结果。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 黄芩苷对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞miR-141和Sirt1表达及细胞凋亡的影响

Western blot实验结果显示，与control组相比，SV40-MES-13细胞经过高糖处理后，Sirt1蛋白水平明显下调，说明高糖抑制SV40-MES-13细胞细胞内Sirt1表达；相比于25 mmol/L组，黄芩苷与高糖共同处理SV40-MES-13细胞后Sirt1水平明显提高(P<0.01),见图1A。qPCR结果显示HG组miR-141的表达水平显著高于control组，黄芩苷可以逆转高糖引起的miR-141水平升高(P<0.01),见图1B。此外，高糖处理引起SV40-MES-13细胞凋亡水平显著升高，黄芩苷可大大抑制高糖引起SV40-MES-13细胞凋亡(P<0.01),见图1C。黄芩苷单独处理SV40-MES-13细胞并不会对Sirt1、miR-141表达和细胞凋亡水平产生明显影响。

Figure 1. The effects of baicalin and high glucose (HG) on mouse glomerular mesangial cells. A: the protein expression of Sirt1 was determined by Western blot; B: miR-141 expression was detected by qPCR; C: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

图1黄芩苷对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞miR-141和Sirt1表达及细胞凋亡的影响

2 敲减miR-141抑制高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡

为了验证miR-141和高糖之间的关系，我们用不同浓度(5.5和25 mmol/L)的葡萄糖处理SV40-MES-13细胞, qPCR结果显示，HG组miR-141的表达水平明显高于control组(P<0.01)，说明高糖环境促进miR-141的表达水平升高; SV40-MES-13细胞转染miR-141 inhibitor后经过高糖处理，实验结果显示miR-141水平下调(P<0.01)可以抑制高糖诱导的SV40-MES-13细胞凋亡(P<0.01),见图2。

3 Sirt1是miR-141直接作用的靶基因之一

为了验证Sirt1与miR-141调控关系，本研究首先通过生物信息在线软件预测miR-141在Sirt1 3’UTR区存在结合位点，见图3A。双萤光素酶报告分析结果显示miR-141 inhibitor与重组报告质粒共转染SV40-MES-13细胞，显著提高了野生型Sirt1 3’UTR(Sirt1 3’UTR-WT)的活性(P<0.01)，但是对突变型Sirt1 3’UTR(Sirt1 3’UTR-MUT)活性没有产生影响；miR-141 inhibitor转染至SV40-MES-13细胞后，Sirt1 mRNA和蛋白水平显著提高(P<0.01),见图3B。此外，miR-141 mimic与重组报告质粒共转染SV40-MES-13细胞，显著抑制了野生型Sirt1 3’UTR的活性，但是对突变型Sirt1 3’UTR活性没有产生明显影响;同时通过向SV40-MES-13细胞转染miR-141 mimic过表达miR-141，Sirt1 mRNA和蛋白水平明显受到抑制(P<0.01),见图3C。上述结果提示Sirt1是miR-141直接作用的靶基因之一。

4 敲减miR-141表达通过上调Sirt1抑制高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞凋亡

为了进一步验证高糖环境、miR-141/Sirt1和小鼠肾小球系膜细胞凋亡三者之间的关系，我们通过向SV40-MES-13细胞转染miR-141 inhibitor或转染miR-141 inhibitor+siRNA-Sirt1再经过高糖处理，观察miR-141/Sirt1水平改变对鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响。结果显示，高糖引起细胞内Sirt1蛋白水平下降和细胞凋亡水平上升；干扰miR-141表达可以逆转高糖引起的Sirt1蛋白水平下降和细胞凋亡水平上升；干扰miR-141对Sirt1蛋白水平和细胞凋亡的作用可以进一步被Sirt1水平的下调所逆转，见图4。这一结果表明，干扰miR-141通过上调Sirt1抑制高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡。

Figure 2. Knock-dowm of miR-141 expression inhibited the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells induced by high glucose (HG). A: miR-141 expression was detected by qPCR; B: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vs25 mmol/L+miR-NC group.

图2干扰miR-141抑制高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡

Figure 3. miR-141 directly regulated Sirt1. A: the binding sites between miR-141 and Sirt1 3’UTR; B: miR-141 inhibitor enhanced the luciferase activity of wild-type (WT) Sirt1 3’UTR and increased the mRNA and protein expression of Sirt1; C: miR-141 mimic inhibited the luciferase activity of WT Sirt1 3’UTR and decreased the mRNA and protein expression of Sirt1. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmiR-NC group;##P<0.01vspre-NC group.

图3Sirt1受到miR-141靶向调控

Figure 4. Knock-down of miR-141 expression inhibited the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells induced by high glucose (HG) through upregulating Sirt1. A: the protein expression of Sirt1 was determined by Western blot; B: miR-141 expression was detected by qPCR; C: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group;&&P<0.01vsHG+miR-141 inhibitor+si-control group.

图4干扰miR-141通过上调Sirt1抑制高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞凋亡

5 黄芩苷通过影响miR-141上调Sirt1抑制高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞凋亡

为了验证黄芩苷对高糖环境下小鼠肾小球系膜细胞的影响，我们通过SV40-MES-13细胞转染miR-141 mimic或转染miR-141 mimic+pcDNA-Sirt1再经过高糖和黄芩苷处理，观察黄芩苷对鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响。结果显示，黄芩苷可以抑制高糖引起的细胞内Sirt1蛋白水平下降和细胞凋亡水平上升；过表达miR-141可以逆转黄芩苷抑制高糖对Sirt1蛋白水平和细胞凋亡的作用；过表达miR-141对鼠肾小球系膜细胞的作用可以进一步被Sirt1的过表达所逆转，见图5。这一结果表明黄芩苷通过影响miR-141上调Sirt1抑制高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞凋亡。

讨 论

DN是最常见的病理性代谢紊乱(糖尿病)诱发的末期肾病，其发病机理错综复杂，尚未完全阐明[6-7]。糖尿病肾病早期形态学变化包括肾小球肥大、系膜扩张和肾小球基膜损伤，这些造成了肾小球屏障功能失调也促进了DN病理的发展[8-10]。此外，研究表明由于高糖更易诱导肾小球系膜细胞凋亡，因此肾小球系膜细胞损伤造成的肾小球病变在DN病理过程中发挥关键的作用[2]。本研究发现高糖可明显诱导肾小球系膜细胞凋亡。黄芩苷为黄芩中一类黄酮类有效成分，其具有抗过敏、抗氧化、抗炎及抑制细胞凋亡等功效[11]，从而发挥对生物机体的保护作用。据研究报道，黄芩苷通过抗氧化和抗炎作用可有效缓解丙酮醛引起的细胞毒性和缓解大鼠的糖尿病肾病[12]；此外，黄芩苷可通过抑制H2O2诱导氧化应激缓解终板软骨细胞凋亡[13]，同时研究表明黄芩苷通过下调凋亡相关蛋白水平抑制肾脏细胞凋亡，从而起到保护肾脏作用[3]。本研究发现加入黄芩苷处理后肾小球系膜细胞凋亡明显得到抑制，由此说明黄芩苷可缓解高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡，但具体机制仍需要进一步研究。

Figure 5. Baicalin inhibited the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells induced by high glucose (HG) via miR-141/Sirt1 signaling pathway. A: the protein expression of Sirt1; B: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group;&&P<0.01vsHG+baicalin+pre-NC group;△△P<0.01vsHG+baicalin+miR-141 mimic+pcDNA group.

图5黄芩苷通过影响miR-141上调Sirt1抑制高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞凋亡

Sirt1是一种依赖NAD+型脱乙酰酶，主要调控能量约束的下游途径有利于维持糖稳态，同时其还参与调控细胞凋亡、分化和衰老以及调控糖和脂类的代谢。Sirt1被发现在糖尿病小鼠三叉感觉神经元中表达下调[14]。研究报道，缺氧条件下，在成骨细胞中过表达Sirt1使细胞内的凋亡蛋白表达下降，从而抑制缺氧引起的细胞凋亡[15]。白藜芦醇通过激活Sirt1活性，使核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)脱去乙酰基激活整个信号通路，引发caspase-3介导的凋亡机制，最终引起软骨肉瘤细胞凋亡[16]。因此这些表明Sirt1在细胞凋亡中扮演着重要角色。本研究中肾小球系膜细胞凋亡与Sirt1密切相关，在高糖诱导下，Sirt1的表达水平明显降低，并伴随着细胞凋亡水平增加。此外，干扰Sirt1在肾小球系膜细胞中表达可以促进细胞凋亡。

越来越多的证据表明miRNAs在Sirt1有关的凋亡途径中发挥着重要的作用。有研究表明多种mi-RNAs通过直接靶向作用于Sirt1而调控细胞的生理过程。在肿瘤研究中，Sirt1可被上游分子miR-138靶向下调从而抑制肝癌细胞的增殖[17]和抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[18]，以及miR-200a可以通过靶向结合Sirt1诱导肾癌细胞凋亡[19]。在糖尿病状态下，miR-34a靶向结合Sirt1，从而负向下调Sirt1/HIF-1α信号途径促进耳蜗毛细胞凋亡，引发糖尿病患者听力障碍[20]。Sirt1的3’-UTR存在miR-211的结合位点，并受其靶向下调诱导晶状体上皮细胞凋亡，介导糖尿病白内障的发展[21]。此外，据报道miR-141作为调控子也涉及参与糖尿病的病理过程[22]。本研究发现miR-141在高糖环境下的小鼠肾小球系膜细胞中表达明显上调，通过对其表达的抑制可有效缓解高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡，并且通过双萤光素酶实验证明，Sirt1是miR-141介导细胞凋亡的下游调控的靶分子之一。

综上所述，本研究表明高糖条件(模拟糖尿病环境)下小鼠肾小球系膜细胞中miR-141表达水平上调，Sirt1表达受到抑制，造成小鼠肾小球系膜细胞凋亡。黄芩苷可以通过抑制miR-141过表达，促进Sirt1表达水平上升，最终缓解高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡，达到治疗糖尿病肾病的作用。