微小RNA miR-148b-3p在人胶质瘤细胞中的表达及意义

李妍哲,李朝晖,王 冠,韦 博

(吉林大学中日联谊医院 神经外二科，吉林 长春130033)

微小RNA(miR)是一种在转录后水平调控基因表达的非编码RNA， 其与肿瘤的发生发展密切相关[1,2]。miR-148b-3p是miR-148家族的一员，在乳腺癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤的发生发展中发挥重要的作用[3,4]。迄今为止， miR-148b-3p在胶质瘤中的表达及生物学意义尚无报道。本研究检测miR-148b-3p在胶质瘤细胞中的表达水平，并探讨其在胶质瘤细胞增殖和侵袭中的生物学意义。

1 材料与方法

1.1材料

DMEM培养基购于南京凯基生物科技发展有限公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，DMSO和MTT购自杭州昊天生物公司， HiFi-鼠白血病病毒反转录酶(MMLV)cDNA第1链合成试剂盒、Ultra SYBR荧光定量PCR试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。Lipofectamine2000和细胞周期DNA含量检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。Matrigel基底膜购于BD公司， Transwell小室购自Millipore公司。

1.2细胞培养

人胶质瘤细胞A172和人星形胶质细胞HA1800均购自中科院上海细胞所。A172细胞和HA1800细胞培养于含青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL、10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、饱和湿度及5%CO2的培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。实验时取对数生长期的细胞。

1.3荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)

Trizol试剂提取总RNA，采用茎环引物法，利用HiFi- MMLV cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA，miR-148b-3p茎环引物序列： 5′GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACC-AGAGCCAACACAAAG3′。逆转录产物用SYBR试剂盒进行荧光定量PCR反应，U6作为内参。miR-148b-3p引物，上游：5′-CGGTCAGTGCATCACAGAA-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6引物，上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qRT-PCR反应条件为95℃，10 min；94℃，30 s， 58℃，30 s，72℃，60 s，40个循环；72℃，10 min。qRT-PCR结果利用2-△△Ct法进行计算分析。

1.4miR-148b-3pmimics合成及细胞转染

miR-148b-3p mimics、miR-148b-3p mimics阴性对照(NC)由百奥迈科生物技术有限公司合成。miR-148b-3p mimics序列为5′-CGGGGAGAGAACGCAGUGACGU-3′，miR-148b-3p mimics NC序列为5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。利用Lipofectamine2000转染试剂转染至胶质瘤A172细胞。实验分为三组：空白对照(Blank)组、NC组和miR-148b-3p mimics组。

1.5MTT法检测细胞增殖

取对数生长期的A172细胞，以2×104/mL的密度接种于96孔培养板上，每孔100 μL。细胞增长至 50%-60%时，转染miR-148b-3p mimics或 NC。于细胞培养箱中继续培养24、48、72 h后，利用MTT法测定细胞的生长活性，生长活性以570 nm波长吸光度OD值表示。计算细胞增殖率，细胞增殖率=实验组OD值/对照组OD值。

1.6Transwell实验检测细胞的侵袭能力

无血清培养基8∶1稀释Matrigel胶，均匀铺于Transwell小室，每孔50 μL，37℃反应30 min。各组细胞以5×104个/孔接种于Transwell小室，在含5%CO2的培养箱中37℃连续培养24 h。用湿棉棒擦去上室底部膜表面上的细胞，揭下底部膜，底部向上晾干后移至载玻片上，用中性树胶封片。显微镜下随机取9个视野计数，统计结果。

1.7Guava微流式细胞分析仪检测细胞周期

收集A172细胞，用PBS洗涤1次，加入700 mL/L乙醇1 mL固定过夜，第2 天离心除去乙醇，用含2 g/L PI的PBS 500 μL重悬，避光孵育30 min，过200目细胞筛，利用Guava easy Cyte 8微流式细胞分析仪检测细胞周期。

1.8统计学方法

2 结果

2.1miR-148b-3p在胶质瘤细胞A172及正常星形胶质细胞HA1800中的表达

qRT-PCR检测A172和HA1800中miR-148b-3p的相对表达量。结果显示，miR-148b-3p在A172和HA1800中的表达量分别为0.27±0.06和1.16±0.21，胶质瘤细胞A172 中miR-148b-3p的表达水平较正常星形胶质细胞HA1800显著降低(P<0.01，图1)。

2.2miR-148b-3pmimics转染对胶质瘤细胞A172增殖的影响

为进一步检测miR-148b-3p mimics对胶质瘤细胞A172增殖的影响，我们利用MTT法比较转染后各组细胞增殖率的变化。MTT结果显示，NC组与Blank组相比，转染24 h、48 h及72 h后细胞增殖率均无明显差异(P>0.05)。miR-148b-3p mimics组与NC组相比，在转染24 h后细胞增殖率下降(12.33±0.46)% (P<0.05)，在转染48 h和72 h后细胞增殖率分别下降(18.35±0.64)% 和(30.54±1.22)%(P<0.01)，结果有统计学差异(图2)。

2.3Transwell实验检测miR-148b-3pmimics对胶质瘤细胞A172侵袭能力的影响

miR-148b-3p mimics转染A172细胞48 h后，收集细胞，转移至Transwell小室继续培养24 h，固定细胞，姬姆萨染液染色，观察胶质瘤细胞A172的侵袭能力。如图3所示，miR-148b-3p mimics组穿过小室基底膜的紫色细胞数较Blank组及NC组明显减少。显微镜下随机取9个视野计数，统计显示，Blank组、NC组及miR-148b-3p mimics组的穿膜细胞数分别为86.4±2.1、87.1±4.6和23.1±1.8，miR-148b-3p mimic组与Blank组及NC组相比较，具有显著统计学差异(P<0.01)，miR-148b-3p mimics组A172细胞侵袭能力显著低于Blank组及NC组。结果表明，miR-148b-3p mimic能够抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。

图1胶质瘤细胞A172及正常星形胶质细胞HA1800中miR-148b-3p的表达量；miR：微小RNA

图2 miR-148b-3p mimics转染对胶质瘤细胞A172增殖的影响

图3 miR-148b-3p mimic转染对胶质瘤细胞A172侵袭能力的影响

2.4流式细胞术检测miR-148b-3pmimics对胶质瘤细胞A172细胞周期的影响

miR-148b-3p mimics转染A172细胞24 h、48 h及72 h后，收集细胞，PI染色，Guava微流式细胞分析仪分析各组细胞周期。结果显示，随着时间的延长，转染miR-148b-3p mimics后的胶质瘤细胞A172 G0/G1期细胞逐渐增加，S期相对减少。结果表明，在胶质瘤细胞A172中miR-148b-3p mimics显著增加细胞周期的阻滞。

3 讨论

胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤，其发生发展涉及非常复杂的分子机制[5]。miRNA 是一类非编码RNA，通过识别并结合靶mRNA 3′末端的种子序列，促进靶mRNA降解或抑制其翻译。已有研究发现多种miRNA 在胶质瘤的生长、侵袭及血管生成等过程中发挥重要的调控作用。吴淳等[6]研究发现miR-140-5p可抑制胶质瘤细胞株U87和U251的增殖，阻滞细胞周期，并显著抑制其侵袭能力。邵灵敏等[7]报道下调miR-19a可上调胶质瘤细胞U87中多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)的表达，进一步抑制U87细胞的侵袭能力。

图4 miR-148b-3p mimics转染对胶质瘤细胞A172细胞周期的影响

miR-148家族由miR-148a、miR-148b、miR-152三位成员构成，其中前体miR-148b包括两个发挥功能的成熟miRNA，miR-148b-3p和miR-148b-5p。miR-148b-3p在多种肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。有研究报道，miR-148b-3p可靶向调控WNT1/β-catenin信号通路，从而抑制肝癌细胞的增殖和侵袭[8]。另有研究发现，miR-148b-3p可负向调控DNA甲基转移酶抑制乳腺癌的增殖和侵袭[9]。对于miR-148b-3p在胶质瘤中的表达情况及作用，至今尚未见报道。

在本研究中，我们检测miR-148b-3p在胶质瘤细胞中的表达水平，并对miR-148b-3p在胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用进行初步探讨。首先利用qRT-PCR方法检测到miR-148b-3p在胶质瘤细胞中的表达水平较正常星形胶质细胞中明显下降。为进一步明确miR-148b-3p在胶质瘤增殖和侵袭中的作用，我们合成miR-148b-3p mimics，利用脂质体瞬时转染法转染至A172细胞，观察miR-148b-3p过表达后对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响。MTT结果显示，miR-148b-3p过表达的A172胶质瘤细胞生长明显受到抑制；细胞周期实验发现miR-148b-3p过表达可以阻滞胶质瘤细胞G0/G1期向S期转换；同时，Transwell实验结果发现miR-148b-3p过表达可以明显抑制A172细胞的侵袭能力。

本研究结果表明，miR-148b-3p在胶质瘤中呈低表达，在胶质瘤中发挥抑制肿瘤细胞增殖和侵袭的作用。