pink1-prkn PARK2通路与线粒体自噬和肝脏急性缺血再灌注损伤的关联研究

刘树雄，何 建

(上海东方肝胆外科医院 急诊科，上海200438)

急性肝脏损伤的发病机制有很多种[1]，包括多种细胞类型，细胞过程，分子介质和调节因子[2-5]。线粒体损伤和功能障碍在急性肝脏损伤的发病机制中起决定性因素，尤其是肝脏小管上皮细胞的损伤和死亡[6,7]。线粒体自噬是线粒体质量控制的重要机制，通过自噬选择性去除过量和有缺陷的线粒体。线粒体自噬除去受精卵中精子衍生的线粒体以确保母体线粒体DNA的遗传，并调整发育红细胞中线粒体的清除[8-10]。线粒体自噬通过自噬途径鉴定并标记受损或功能失调的线粒体。在哺乳动物细胞中，线粒体自噬包括调节自噬诱导和受损线粒体激发，从而选择性自噬识别[11,12]。本研究即探究pink1-prkn PARK2通路与线粒体自噬和肝脏急性缺血再灌注损伤的关联。

1 材料和方法

1.1动物模型的制作

C57BL/6小鼠(8至10周，雄性)购自中科院上海实验动物中心(上海，中国)。pink1-KO和park2-KO小鼠按照先前描述得到。将Pink1-KO小鼠与Park2-KO小鼠杂交以产生Pink1Park2 double-KO小鼠。戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后对小鼠进行监测和维持体温至约36.5℃。通过侧面切口暴露肝脏蒂进行双侧夹闭以诱导30分钟的缺血，释放夹子进行再灌注。

1.2方法

1.2.1组织病理学 使用DICT-500试剂盒(南京碧云公司)测量血清肌酸酐以检测肝脏功能。将肝脏组织用4%多聚甲醛固定，包埋在石蜡中，并切成4 μm厚。

1.2.2SP3的免疫组织化学染色 将石蜡包埋的肝脏切片脱石蜡并在65℃和pH6.0条件下用0.1M柠檬酸钠温育用于抗原修复，用VECTASTAIN○RABC标准试剂盒(Vector Laboratories，PK-4000)和DAB过氧化物酶底物试剂盒(Vector Laboratories，SK-4100)显示抗原-抗体复合物的信号。载玻片用DAPI(Sigma-Aldrich，D9542)复染。通过相差显微镜检测阳性细胞染色。

1.2.3干扰RNA转染 siRNA寡核苷酸的序列如下：PINK1 sI-RNA，5′-ccaggctgggccgcaggaccg;PRKN sI-RNA，5′-ggatcagcagagcattgttca;对照sI-RNA，5′-uucuccgaacgugucacgu。使用Lipofectamine 2000试剂(Thermo Fisher Scientific，11668019)，用质粒DNA或RNAi瞬时转染HK-2细胞。

1.2.4ATP耗竭 HK-2细胞用磷酸盐缓冲盐水(137 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM NaHPO4,and 1.8 mM KH2PO4,pH 7.4)清洗，然后在含20 mM CCCP的无糖RKRB缓冲液(115 mM NaCl,1 mM KH2PO4,4 mM KCl,1 mM MgSO4,1.25 mM CaCl2,25 mM NaHCO3,pH 7.4)中2-6 h诱导ATP耗竭，在正常培养基中恢复2 h模拟再灌注。

1.2.5细胞凋亡分析 根据制造商的说明使用原位细胞死亡检测试剂盒应用于TUNEL分析。用荧光显微镜检测核DNA碎片的阳性染色。为了定量，从每个组织切片中选择10个代表性的区域并评估每平方毫米 TUNEL阳性细胞的量。

1.2.6线粒体分离和量化 从肝脏缺血再灌注和假手术对照小鼠收获肝脏皮质和外髓质，测量线粒体DNA含量。

1.2.7测量HK-2细胞中的线粒体ROS 37℃下HK-2细胞与10 μM DHE在潮湿且黑暗的室中温育30分钟，然后用DAPI(Sigma-Aldrich ，D9542)复染。利用共焦显微镜获得荧光图像。为了量化，使用ImageJ software测定10个随机光学切片内近端肝脏细胞核中的荧光密度。

1.2.8免疫印迹分析 在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，在被转移到聚偏二氟乙烯膜上后，用5%脱脂牛奶封锁并用探针探测一抗和辣根过氧化物酶缀合的二抗(Thermo Fisher Scientific，31430和31460)。用增强型化学发光试剂盒(Thermo Fisher Scientific，32106)显示抗原。ACTB或PPIB用于监测蛋白质加载和转移。为了定量，利用ImageJ软件(NIH)分析蛋白质带。

1.3统计分析

采用SPSS20.0统计软件；计量资料采用“均数±标准差”表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率(%)表示，比较采用χ2分析；P<0.05代表差异有统计意义。

2 结果

2.1线粒体吞噬是由HK-2细胞中的ATP耗竭

在免疫印迹分析中，ATP D-R诱导LC3B-Ⅱ的快速增加和SQSTM1(图1的A-1C)的显著下降，自体吞噬激活的2个生化标志。ATP D-R期间LC3B-Ⅱ和SQSTM1的变化与线粒体内膜蛋白TIMM23的显著减少和 TOMM20相关联(图1)。

图1 在HK-2中诱导线粒体自噬以应对ATP耗竭-补充

2.2HK-2细胞中，PINK1和PRKN/PARK2参与ATP耗尽-补充诱导的自噬

针对ATP D-R，HK-2细胞显示PINK1和PARK2的表达显著增加(图2A和2C)，这表明PINK1-PRKN/PARK2途径对ATP D-R反应的肝脏细胞线粒体自噬起关键作用(图2)。

图2PINK1和PRKN/PARK2参与ATP耗尽-补充诱导的HK-2细胞自噬

2.3PINK1或PRKN的沉默使HK-2细胞对ATP耗竭-补充诱导的细胞凋亡敏感

HK-2细胞中，无论PINK1和PRKN的状态怎样，对照条件下的凋亡都是最小(图3)。

图3 PNK1和PRKN的沉默使细胞对ATP耗竭诱导的细胞凋亡敏感

2.4肝脏缺血再灌注诱导小鼠近端肝脏细胞的线粒体自噬

收集肝脏皮质组织进行免疫印迹分析，肝脏I-R诱导LC3B-Ⅱ、PINK1和PARK2的显著增加，伴随TIMM23和TOMM20的显著降低(图4)。

图4 小鼠肾缺血再灌注后近端肾小管上皮细胞发生线粒体吞噬

2.5肝脏缺血再灌注诱发更严重的Pink1和(或)肝脏损伤Park2-缺陷小鼠

活化CASP3的免疫组织化学染色也显示突变肝脏中活化的CASP3阳性肝脏细胞多于WT肝脏。TUNEL测定和激活的CASP3染色均证明肝脏I-R后pink1和park2单敲除或双敲除小鼠具有高水平的肝脏细胞凋亡(图5、图6)。

图5 Pink1和/或Park2缺陷恶化肝脏缺血再灌注引起的肝脏损伤

3 讨论

自噬诱导已经在多个急性肝脏损伤实验模型中得以证实。自噬抑制剂增强急性肝脏损伤而自噬活化剂显示出保护作用，这表明自噬在该疾病状态的肝脏保护作用。自噬的保护作用，尤其是对肝脏细胞的保护作用，通过自噬缺陷小鼠模型的测试进一步确定。尽管有这些研究，但细胞自噬是如何保护急性肝脏损伤肝脏细胞仍未可知。目前，该领域至少有两种思想来解释自噬的细胞保护作用。第一，自噬和细胞死亡共享信号通路，自噬的激活可能影响细胞死亡。这方面一个很好的例子是BECN1，其通常结合BCL2，但细胞应激时它与BCL2分离开始形成用于自噬的Ⅲ类磷脂酰肌醇3激酶复合物。本研究表明，通过线粒体自噬去除受损的线粒体是自噬提供肝脏保护的重要机制。

PINK1和PRKN/PARK2在介导缺血性急性肝脏损伤肝脏细胞线粒体自噬中的作用。HK-2细胞中PINK1和PRKN的沉默抑制ATP D-R期间的线粒体自噬，但对一般或非选择性自噬没有显著影响，表明RNAi介导的PINK1和PRKN敲除不足以抑制一般自噬。这一结果并不令人意外，因为线粒体自噬是自噬的选择性形式，需要一种独特的启动过程，即ATP D-R期间在肝脏细胞中由PINK1-PRKN/PARK2介导。在PINK1-PRKN/PARK2途径中，普遍认为PRKN/PARK2介导的MOM上线粒体蛋白质的泛素化对于自噬诱导至关重要。Lazarou等最近的报道认为PINK1可独立于PARK2直接聚集自噬受体诱导线粒体自噬。相反，Kubli等表示在心肌细胞中，PARK2聚集到线粒体中用于线粒体蛋白泛素化和线粒体自噬，而与PINK1无关。在急性肝脏损伤期间，由于线粒体动力学从融合变为裂变，线粒体在相当数量的肝脏细胞中变成碎片且线粒体碎裂导致肝脏细胞死亡。急性肝脏损伤进展为慢性病理过程中，一些肝脏细胞中持续存在于破碎的线粒体。

图6 在肝脏I-R损伤期间， Pink1 和/或 Park2 敲除增加肝脏细胞凋亡。

除了损害细胞能量学之外，受损线粒体可通过产生过量ROS来诱导细胞毒性。尽管pink1和park2单敲除或双敲除小鼠在肝脏I-R后具有可比较的ROS水平，但park2-KO和pink1 park2-dKO小鼠肝脏组织比pink1- KO小鼠显示明显更多的巨噬细胞和嗜中性粒细胞，表明PARK2可能对炎症有某些额外作用。在这方面，脱离自噬降解的线粒体DNA也可以激活炎症。因此研究PARK2是否参与线粒体DNA清除和释放的调节会很有意思。

PINK1和PRKN/PARK2可能具有除线粒体自噬外的其他功能。例如，PINK1和PRKN/PARK2调节线粒体中的囊泡运输。PINK1还可调节复合物I活性从而参与调节线粒体生物能量学。在先天免疫方面，PRKN/PARK2可促进细胞内细菌病原体的自噬降解。最近发现PINK1和PRKN/PARK2在内毒素和热应激条件下通过负调节线粒体衍生的囊泡通路来抑制线粒体抗原呈递。因此，调查PINK1和PRKN/PARK2在肝脏疾病如急性肝脏损伤中与线粒体自噬无关的功能很有意义。

综上所述，本研究证实了缺血性急性肝脏损伤体外和体内模型中线粒体自噬激活的实质性证据。此情况下的线粒体自噬主要由PINK1-PRKN/PARK2途径介导。通过清除受损的线粒体，PINK1-PRKN/PARK2介导的线粒体自噬在维持线粒体质量中起重要作用，帮助肝脏细胞存活并从缺血性应激中恢复。此外，及时清除受损线粒体也能减少ROS的产生和炎症。