基于主成分分析和聚类分析的 苹果香气成分比较及品种分类研究

张薇薇,张秀玲

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

苹果是世界上最重要的水果之一,也是世界四大水果之一,深受消费者喜爱。苹果是我国膳食的重要组成部分,在水果领域中具有重要的地位[1]。苹果中含有丰富的维生素C、维生素A、胡萝卜素、钙、铁和钾等,可以为人体补充所需的多种维生素和矿物质[2]。在中国,无论其种植面积还是产量均位居各水果之首。我国2015年苹果总产量为4260万吨,2016年苹果总产量达4350万吨,其中2016年产量占世界总产量的56%[3]。苹果品种数以千计,我国的主要品种有:辽伏、新红星、乔纳金、秦冠、王林、富士系品种、澳洲青苹、国光、红将军、乔纳金、华冠、栖霞苹果—红富士、花牛、金帅等。

在近些年的研究中,香气成分已逐渐受到重视。研究发现在果品鲜食、加工质量等领域中,香气已成为品质评价的重要因素[1],因此研究苹果果实香气,能够为改善苹果品质和苹果深加工提供理论参考[4]。目前针对苹果香气的研究大部分集中于单一品种且对香气成分处在初步检测阶段。Wu等[5]对8个品种的苹果进行香气化合物探究,得出酸、糖是影响苹果香气的主要原因。Farneti等[6]研究苹果的动态挥发性有机化合物并建立了香气化合物动态模型。Young等[7]对苹果中酯类物质的变化进行了研究。Seppä等[8]研究了苹果在贮藏过程中香气和质构的变化特征。Varela等[9]对富士苹果在货架期内香气的变化规律进行了探讨,确定醇、酯、醛、酮是主要的香气成分。Moyaleon等[10]对气调贮藏条件下皇家嘎啦的香气变化进行了讨论,发现气调贮藏可以抑制香气中酯类物质的生成。以上实验均对单一品种进行香气研究,并未对多品种香气成分进行比对探讨。因此,本实验主要对不同产地不同品种苹果进行香气检测,并对香气化合物进行定量,采用多元统计分析法中的主成分分析对苹果香气物质进行分类,旨在为苹果香气研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果 本实验采用来自7个产地14个品种,分别是辽宁兴城国光、新红星、华富、秋锦、昌红、乔纳金、新民寒富、山东泰安小国光、山东泰安红富士、山西秦冠、甘肃富士、河北王林、河北富士和新疆冰糖心富士,苹果分别采摘自不同果树,每个品种共取50个,以上苹果成熟度为8～9成,采收时间为2016年11月;NaCl、2-辛醇 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

WZB 45数显折光仪 上海精密科学仪器有限公司;D25LT可见光色度计 美国Hunter Lab公司;TA-XT2i质构仪 英国Stable Micro systems公司;BSA4202S(0.01 g)电子天平 德国Sartorius公司;GMK-835F型苹果酸度计 常州锐品精密仪器有限公司;SPME自动进样器AOC5000 日本岛津公司;PDMS、PDMS/DVB、CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司;GC/MS-QP2010Plus、聚四氟乙烯隔垫 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 硬度的测定 硬度(果皮硬度和果实硬度)使用质构仪进行测定,果皮硬度为探头感应到的最大值(N)。测定硬度时选取苹果果实阴阳面,各取3个点进行测定。果实硬度值为用感应力平衡后5～10 s之间测定的感应力的连续积分平均值。分别选取14个品种的苹果,每个品种取25个重复。

1.2.2 可溶性固形物的测定 参照NY/T2637-2014[11]测定可溶性固形物含量。分别选取14个品种的苹果,将苹果洗净,均匀切丁,放入搅碎机中打碎,每个苹果称取5 g。用蒸馏水调零数显折光仪,随后将打碎的苹果分别滴入折光仪中,测定可溶性固形物数值。分别选取14个品种的苹果,每个品种取25个重复。

1.2.3 色泽的测定 果皮颜色(L*值,a*值,b*值)采用D25LT可见光色度计在L*、a*、b*模式下测定[12]。分别选取14个品种的苹果,每个品种取5个重复。将苹果清洗、擦干,用去皮器削去果皮,平铺于面板上。开机校正色差仪,随后将探头按于果皮表面,测定果皮色泽,之后将苹果切开,迅速测定果肉色泽,每个苹果重复5次。

1.2.4 总酸的测定 参照GB/T 12456-2008[13]测定总酸含量,采用酸度计测定。分别选取14个品种的苹果,每个品种取25个重复。

1.2.5 香气成分的提取 参考实验室前期研究结果,将每个品种苹果随机挑选若干,洗净四分法切分,之后切成细碎颗粒混匀,准确称量2 g于顶空瓶中,并在顶空瓶中加入2 mL去离子水、0.6 g NaCl,以便使芳香物质充分散发出来。再将100 μL内标2-辛醇(体积浓度为0.822 mg/L)加入顶空瓶内,然后用聚四氟乙烯隔垫盖上密封,采用固相微萃取-气相-质谱(SPME-GC-MS)进行香气的检测。每个品种三个平行试验。

1.2.6 SPME-GC-MS测定条件 SPME条件:本实验采用的萃取头为65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯(PDMS/DVB),实验前须先在220 ℃老化40 min后使用。磁力搅拌器转速为240 r/min,萃取温度为40 ℃,萃取的吸附时间为50 min。

气相色谱条件:色谱柱DB-WAX,30 mm×0.25 mm×0.25 μm,解析温度为200 ℃,解析时间为5 min,升温程序为初始50 ℃保持3 min,以8 ℃/min的速度升到120 ℃,再以15 ℃/min升温到220 ℃保持5 min。载气为高纯氦气(纯度为99.999%),恒压52.5 kPa,总流量36.8 mL/min,流速为35.9 mL/min,无分流进样。

质谱条件:离子能量80 eV,质谱接口温度为250 ℃,扫描质量范围为35～500 u,离子源温度为180 ℃,电离方式EI,解析时间3 min。

1.2.7 定性分析与定量分析 定性分析:将固相微萃取所得香气成分,用气相色谱-质谱联用仪进行分析鉴定。通过G1701BA数据处理系统并检索谱图库,然后与EPA/NIH质谱图集的标准谱图进行对照,选择与谱库匹配相似度大于85的化合物作为该峰的定性化合物,再结合相关文献进行解析。定量分析:通过G1701BA数据处理系统,通过峰面积对比,以得到苹果中各香气成分的相对含量。

1.3 数据处理

本实验所得数据均使用Microsoft office excel 2010和SPSS Statistics 21软件进行描述性分析、主成分分析、聚类分析的统计分析。

2 结果与分析

2.1 基本理化指标

测定本实验所用14种苹果的6个品质性状,其结果见表1。

描述性统计是用来概括、表述事物整体状况以及事物间关联、类属关系的统计方法。通过统计处理可以简洁地用几个统计值来表示一组数据的集中性和离散性(波动性大小)。本实验将测得的不同品种苹果基本理化指标进行描述性分析,用以比对不同品种苹果间理化指标的差异。将14个苹果品种进行描述性分析,结果见表2。其中,果肉L值的变异系数为2.6%,不同品种间果肉L值变异系数较小,说明不同品种间果肉的亮度值差异不显著(p>0.05)。本试验结果表明,除该项指标未表现出较大的变异系数外,其余7项指标的变异系数均较大,这说明不同品种苹果间品质指标差异性较大。果肉颜色a值的变异系数为305.88%,其数据离散程度较大,表明各苹果品种间的测定值差异较大,此结果可能与苹果果肉中多酚氧化酶的活性指标相关,多酚氧化酶活性较高时,果肉色泽易发生变化[14]。比较数据的均值和中位数发现,除果肉a值外,其他品质指标的中位数均接近其平均数,说明这些数据的离群点较少。以上试验结果表明,试验所选苹果品种各指标均在接受范围内,离群点较少,具有一定的广泛性和代表性。在本研究中所选取的苹果具有相同栽培管理条件和成熟度,因此苹果果实品质性状的多样性主要是由品种及地域差异造成的[15-17]。

表2 苹果品质描述性统计Table 2 Descriptive statistics of apple characterization

2.2 香气构成

采用SPME-GC-MS测定并分析苹果中香气成分,共鉴定出70种化合物,用峰面积归一化法计算各组分的相对含量[18]。其中,酯类33种、醛类11种、醇类19种、酮类2种、其他类6种。

经检测14种苹果中共有香气成分为8种,分别是乙酸己酯、己酸己酯、2-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛醇、己醛、反式-2-己烯醛、α-法呢稀。己酸乙酯在小国光、秋锦、王林、(新)冰糖心富士、寒富、(甘)富士和(河)富士中检测到,顺式二己烯一醇乙酸酯在秋锦、(山)富士、王林、(新)富士、华富、(甘)富士、(河)富士和乔纳金中检测到,乙酸丁酯在(山)富士、王林、(新)冰糖心富士、(甘)富士和(河)富士中检测到,反式-2-己稀-1-醇在新红星、秦冠、(新)冰糖心富士、寒富、昌红和乔纳金中检测到。在不同苹果品种中,1-己醇、己醛和反式二己烯醛3种组分的含量最高,其相对含量之和都占到各自总含量1%～50%,成为苹果典型风味的基本物质[19]。通过检测可以发现,天然存在于苹果中的香气成分为乙酸己酯、丁酸己酯、己酸己酯[20]。不同产地富士苹果成熟的最佳标志是香气成分中含有2-甲基丁基乙酸酯[21-22],导致苹果皮褐变的主要成分为α-法呢烯的氧化产物[18]。通过本试验检测结果,不同产地富士品种中检测出的共有成分为乙酸己酯、α-法呢稀、顺式-2-己烯-1-醇乙酸酯、己酸己酯、2-甲基丁酸丁酯、1-己醇、1-丁醇、己醛、2-甲基丁基乙酸酯、反式-2-己烯醛、乙酸丁酯、2-甲基-1-丁醇,且根据实验可以看出富士品种虽产地不同,但主要呈香成分差异不大。而通过查阅文献可知1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、己醛、2-甲基丁酸丁酯是富士苹果中典型芳香成分[23],山东富士苹果中上述组分比较丰富,明显高于其它三个产地。由本实验可以看出,相同苹果品种在不同产地由于受气候、土壤等因素的影响,香气成分含量有差异,整体成香成分差别明显,此结论与何义等[24]所得出结论一致。另外,本实验发现不同产地不同品种苹果主要成香组分有1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、l-己醇、己醛、反式-2-己烯醛、乙酸丁酯、乙酸戊酯、2-甲基丁酸丁酯、乙酸苯甲酯[25],由于品种及产地不同导致其组分和含量均存在区别。此外,本实验检测结果显示4-己烯-1-醇乙酸酯仅在秋锦中检测到,这可能与苹果自身品种有关;2-甲基丁酸丁酯仅在(山)富士中检测到,2-甲基丁酸乙酯仅在(新)冰糖心富士中检测到,而其他产地富士中均未检测到该成分,此结果可能与苹果种植产地有关。乔纳金苹果中辛酸己酯含量较高;昌红苹果中顺式-3-己烯-1-醇和乙偶姻含量较高;华富苹果中乙醇含量较高,以上检测成分均可能是构成不同品种苹果呈香的风味物质。

表3 不同品种苹果主要香气成分相对含量(%)Table 3 The relative content of the main aroma components of different varieties of apples(%)

续表

香气值是香气物质浓度与香气物质阈值的比值[26],因此香气值的概念常被引用于香气分析中。检测出的香气成分香气值越大,表明该成分对食品香气所起的作用就越大,而当香气值恰好为1时,表明该成分可以对食品香气起作用;而香气值小于1,则表示该成分对嗅觉器官无明显作用。因此,香气值可以作为评价食品香气特性的依据[23]。由表4可知,本实验检测出富士共有的香气成分中香气值均大于1的成分为2-甲基丁酸乙酯、l-辛醇、己酸乙酯、己醇、2-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯、乙酸己酯,由此可以推断这些成分对富士苹果的呈香起关键作用。己醛、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、己酸乙酯虽然在苹果中含量不是很高,但由于这些成分具有非常低的阈值,因此这三种组分对苹果特有的香气也起着重要的作用[23]。经查阅文献发现,富士苹果最主要的挥发性香气成分是2-甲基丁基乙酸酯,该成分具有香蕉和苹果的气味[27]。由文献可知,乙醛呈青香气味,乙酸乙酯似醚气味,丙酸乙酯具有青苹果气味,2-甲基-1-丁醇香味清爽,1-己醇具有水果香味,反式2-己烯醇有强烈的青香气味且有蔬菜香和草香气息,己酸乙酯具有苹果香,丁酸乙酯呈甜苹果香,己醛具有青酸苹果香,乙酸己酯具有甜苹果香,乙酸丁酯呈菠萝果香[28]。

表4 主成分分析解释总差异Table 4 Principal component analysis explains the total difference

2.3 主成分分析

将检测结果进行主成分分析,分析结果如表4。主成分特征值大于1,方差贡献率分别为51.110%和19.265%,其累积方差贡献率为70.367%,综合了不同品种苹果香气成分的大部分信息。因此,提取前2个主成分较为合适。主要综合了醛类、酮类和酯类物质等信息的第一主成分中,醛和酮呈正向分布,酯类和醇类呈负项分布。由于醛类物质在第一主成分中占比较高,因此醛类物质是PC1的代表成分。第二主成分PC2方差贡献率为19.265%,主要包括酯类和其他类物质的主要信息,其中,酯类物质在在第二主成分的负半轴,其他类物质在正半轴。由于酯类物质在PC2中占比较高,因此酯类物质是PC2的代表成分,荷载图如图2。通过图2可以看出,王林及富士品种苹果大部分均在PC2的负半轴,说明王林及不同产地富士苹果酯含量较高,而昌红则在正半轴,说明昌红品种醇类物质含量较高;秋锦、新红星和国光均落在PC1正向区间,说明这其醇含量较高;华富、秦冠、小国光、河北富士、甘肃富士、寒富各个成分含量较为均匀。

表5为各类香气主成分载荷矩阵与特征向量,根据表5建立前两个主成分的线性回归方程:PC1=-0.965×Zscore(酯类)-0.598×Zscore(醇类)+0.763×Zscore(醛类)+0.702×Zscore(酮类)+0.131×Zscore(酸类)+0.245×Zscore(其他类)

表5 主成分载荷矩阵与特征向量Table 5 Loading matrix and eigenvectors of principal components

PC2=0.840×Zscore(酯类)+0.207×Zscore醇类)+0.407×Zscore(醛类)+0.292×Zscore(酮类)-0.279×Zscore(酸类)-0.427×Zscore(其他类)

式中，Zscore为经过标准化后的数值。

图1 主成分载荷图Fig.1 Plot of principal component analysis

本实验利用权重系数将不同产地不同品种苹果进行排名分析,计算结果如表6所示。由表6可知,综合得分前两名为寒富和昌红,以上品种均位于载荷图第二象限,昌红品种的醇含量较高,而富士品种的酯类和醇类物质含量均较高,且各项成分含量较为均匀。综合得分第3～10名位于载荷图第三象限和各个象限的交界处。综合得分第10到最后一名为华富、国光、秦冠和秋锦,综合得分第13名为秦冠。此结果可以直观的通过香气成分显示苹果品种的优劣。

表6 不同种类苹果的综合得分和排名Table 6 Comprehensive scores and ranks of different cultivars of apple

2.4 聚类分析

使用 SPSS 21分析软件,聚类方法为组间联接,结果如图2所示。由图2可知,当类间距为25时,将14种苹果分为两类。第一类聚集了12个品种,即山东富士、王林、新疆冰糖心富士、寒富、小国光、华富、秦冠、甘肃富士、乔纳金、河北富士、昌红、秋锦。以上品种的各香气成分含量无明显差异,此结果与主成分分析结果一致。第二类主要聚集了2个品种,即新红星和国光。该类品种醛类化合物含量最高,其中E-2-己烯醛含量明显高于其他品种。当类间距为15时,将14种苹果分为四类。第一类聚集了11个品种,即山东富士、王林、新疆冰糖心富士、寒富、小国光、华富、秦冠、甘肃富士、乔纳金、河北富士。该类品种酯类物质的含量较高,其余各组分含量均匀,无明显差异。第二类聚集了2个品种,即新红星和国光,这与主成分分析中PC2分析的结果一致。该类品种醛类化合物含量最高,其中E-2-己烯醛含量明显高于其他品种。秋锦和昌红自成一类,昌红品种中醇含量显著高于其他品种,秋锦中α-法呢烯含量明显低于其他品种,这与主成分分析中PC1分析结果一致。

图2 聚类分析谱系图Fig.2 Dendrogram of HCA(hierarchical cluster analysis)

3 讨论

研究发现,苹果中香气成分有酯类、醛类、醇类和烃类等[29-31],目前已检测出的300余种挥发性香气成分,大部分是酯类,少部分是醇类与醛类,其中仅有约20种特征性香气成分可以决定果实的气味。研究发现,虽然有些成分含量非常少,但由于其具有较低的阈值,所以能够影响果实的整体香味[32]。本试验所用的辽宁兴城国光、新红星、华富、秋锦、昌红、乔纳金、新民寒富、山东泰安小国光、山东泰安红富士、山西秦冠、甘肃富士、河北王林、河北富士和新疆冰糖心富士共检测出73种香气成分,主要特征香气成分有丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、与2-甲基丁酸己酯等,这四种成分中,乙酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯被描述为“果香型”[33-35],如王林为果香型苹果品种;2-甲基丁酸己酯被描述为“肉质果香型”[28],如秦冠和乔纳金等为肉质果香型苹果品种,以上香气成分均为参试苹果品种提供了基本的香味特征;其它特征香气成分,如1-丁醇和2-甲基-1-丁醇,分别被描述为“甜香型”和 “令人愉悦型”香气成分[34],代表品种为富士。香气成分的不同决定了品种果实香味的特异性,根据文献记载[23],酯类含量较高的苹果品种称为浓香型苹果,醛类含量较高的称为清香型苹果,本试验中具有代表性的浓香型苹果为新红星和富士,清香型苹果国光和华富等。另外,研究发现食品香气的最终表达不仅与单一香气成分有关,同时也与香气成分种类数有关[36]。

4 结论

本实验拟为苹果香气分析及分类提供理论支持。通过对辽宁兴城国光、新红星、华富、秋锦、昌红、乔纳金、新民寒富、山东泰安小国光、山东泰安红富士、山西秦冠、甘肃富士、河北王林、河北富士和新疆冰糖心富士的芳香物质研究,发现苹果的主要香气成分包含醇类、酯类、醛类、酮类、醛类和其他类6类香气物质。其中2-甲基-1-丁醇、丁酸乙酯、己醛、乙酸丁酯、丙酸乙酯、己醇、2-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、1-丁醇、己酸乙酯为不同产地不同品种苹果的主要香气成分,不同产地不同品种苹果在醇、醛和酯类上存在一定差异。苹果因不同的香气成分而表现出不同气味,如本实验中的甜香型苹果新红星、王林和富士,清香型苹果国光和华富,均可根据具体香气成分差别将其进行分类。由此可见,香气成分可以作为苹果品种选育和标准评价的指标。而主成分分析与聚类分析则可以有效的区分苹果品质优劣并进行品种筛选。本实验经过分析筛选,得到的不同产地富士、王林、昌红和寒富四种苹果香型特点更为突出,为育种者和消费者优选苹果的提供理论基础和参考。