章鱼内脏加工海鲜调味料的工艺优化

樊佳欢,叶 颖,毛伟杰

(广东海洋大学食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室, 广东省海洋食品工程技术研究中心,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室, 广东普通高等学校水产品高值化加工与利用团队,广东湛江 524088)

章鱼又名八爪鱼,广泛分布于浅水中,其肉嫩味美,营养丰富,是一种典型的海洋生物。2016年,我国章鱼年捕捞量达13.7万t[1]。章鱼在加工过程中除其腕部、躯干肉质被加以利用外,会产生大约50%的下脚料,其中包括内脏、皮、眼窝、脖子等,大部分被废弃[2],造成极大的污染与浪费。而且,这部分下脚料中含有多糖、牛磺酸、脂肪酸等多种生物活性物质,有很高的利用价值[3]。章鱼下脚料还含有丰富的风味物质,适合用于生产海鲜调味料。近年来，关于章鱼内脏的研究主要集中在其有效活性成分提取或酶解工艺优化方面[2-8],但是蛋白质酶解物普遍存在苦腥味较重的问题,关于章鱼内脏酶解液的脱腥问题还需要进一步探讨。本文首先探讨章鱼内脏的酶解条件,然后采用掩蔽法即通过添加胡椒粉、姜蒜粉等香辛料来掩盖酶解液苦腥味,探讨添加物的种类和添加量对调味料口感的影响。以期为充分利用章鱼内脏、减轻环境污染、开发新型海鲜调味料提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

中国水章鱼内脏 购于湛江市东洋水产公司,1 h内运到实验室,取出章鱼内脏后贮藏于-70 ℃冰箱;加碘精盐 广东省盐业集团有限公司;纯正白砂糖 太古糖业有限公司;姜蒜粉 上海味好美食品有限公司;胡椒粉 汕头市熊记食品有限公司;食用(玉米)淀粉 佛山市顺德区金鼎盛调味食品有限公司;胰蛋白酶(50000 U/g) 国药集团化学试剂有限公司;氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 广东光华化学厂有限公司;其他试剂 均为国产分析纯。

BXH-65电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司;HANGPING FA2004电子天平 上海天平仪器厂;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英峪予华仪器厂;PB-10 普及型pH计 德国Sartorius公司;XW-80A漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;UV-3200PC分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;90-1离心机 上海手术器械厂;DL-5-B低速大容量多管离心机 上海安亭科学仪器厂;NE-1001旋转蒸发仪 广州托普仪器有限公司;HHS恒温水浴锅、SX2-4-10马弗炉 上海博迅实业有限公司;722S分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 章鱼内脏基本成分的测定 水分:直接干燥法,参照GB/T 5009.3-2016;脂肪:索氏提取法,参照GB/T 5009.6-2016;蛋白质:凯氏定氮法,参照GB/T 5009.5-2016;灰分:550 ℃灼烧法,参照GB/T 5009.4-2016;氨基酸态氮:甲醛电位滴定法,参照GB/T 5009.235-2016。

1.2.2 工艺流程 章鱼内脏→清洗→打浆→加酶→调节pH→恒温酶解→灭酶→4000 r/min,离心10 min(上清液)浓缩→调味→浓缩→干燥→成品。

1.2.3 酶解液的制备 取章鱼内脏常温解冻后清洗,按一定料水比打出匀浆,加入胰蛋白酶摇匀,用1% NaOH或1%盐酸调pH至一定值,放置一定温度的振荡器中,酶解一定时间后取出,60 ℃下灭酶20 min,冷却后以4000 r/min离心20 min得澄清透明酶解液。

1.2.4 影响章鱼内脏酶解效果的单因素实验 据商家提供数据,胰蛋白酶在酶液浓度为0.25%,pH为7.0、温度为37.0 ℃时,胰蛋白酶酶溶液的作用能力最强。取章鱼内脏匀浆在参考1.2.3数据的基础上进行以下单因素实验。

1.2.4.1 胰蛋白酶的作用浓度 固定反应条件为酶解时间为6.0 h、底物溶度为20.0%、酶解pH为7.0、酶解温度为60 ℃,参考文献[4,9-11]先选取0.5%浓度的胰蛋白酶进行预实验,研究结果表示以1.0%为间隔增大时,结果变化明显,故调整了1.0%为间隔。所以探讨不同胰蛋白酶的作用浓度(E/S)(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%)对章鱼内脏的水解度的影响。

1.2.4.2 时间 固定反应条件为胰蛋白酶的作用浓度2.0%、底物溶度为20.0%、酶解pH为7.0、酶解温度为60 ℃,参考文献[4,12-13]探讨不同酶解章鱼内脏的时间(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 h)对章鱼内脏的水解度的影响。

1.2.4.3 底物浓度 固定反应条件为酶解时间为8.0 h、胰蛋白酶的作用浓度2.0%、酶解pH为7.0、酶解温度为60.0 ℃,参考文献[10,14]先选取5.0%浓度的胰蛋白酶进行预实验,研究结果表示以5.0%为间隔增大时,结果变化不明显,故选取了10.0%为间隔。所以探讨不同酶解底物浓度(5.0%、10.0%、20.0%、30.0%、40.0%)对章鱼内脏的水解度的影响。

1.2.4.4 酶解温度 固定反应条件为底物溶度为10.0%、胰蛋白酶的作用浓度2.0%、酶解pH为7.0、酶解时间为8.0 h,参考文献[4,10,15]探讨不同酶解章鱼内脏的温度(30、40、50、60、70 ℃)对章鱼内脏的水解度的影响。

1.2.4.5 酶解pH 固定反应条件为酶解温度为40 ℃、胰蛋白酶的作用浓度2.0%、底物浓度为10%、酶解时间为8.0 h,参考文献[10,15-16]探讨不同胰蛋白酶水解的pH条件(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)对章鱼内脏的水解度的影响。

1.2.5 正交试验设计 根据单因素试验结果,选取酶的作用浓度(E/S)、酶解底物浓度、酶解温度这三个因素进行3因素3水平的正交试验,正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计表Table 1 Factors and levelsTable of orthogonal experiment

1.2.6 水解度的计算 参照GB/T 5009.235-2016测定出氨基酸态氮，参照GB/T 5009.5-2016测定出总氮,两者相除得出水解度,计算公式如下:

1.2.7 胰蛋白酶的酶活测定及计算 采用紫外分光光度法测定酶的活性，首先配制浓度为100 ug/mL酪氨酸标准溶液，然后用紫外分光光度计于275 nm测定其吸光度(A)，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线, 根据回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg)，即为吸光常数K值(其K值应在130～135范围内),计算公式如下：

式中:X-样品的酶活力,U/mL;A-试样溶液的平均吸光度,nm;K-吸光常数;8-反应试剂的总体积8.00 mL;2-吸取酶液2.00 mL;1/10-反应时间10 min,以1 min计;n-稀释倍数;E-紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0.50;酸性蛋白酶系数为0.77)。

注:在40 ℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。

1.2.8 海鲜调味料的调配 根据海鲜调味料的呈味特点及调味原理[15,17-19],选取最佳酶解条件作用后的15%海鲜风味基料与盐、糖、胡椒粉及姜蒜粉(生姜粉和大蒜粉以1∶2比例混合)进行调味,并以表2作为评价指标,通过8名食品专业人员对试样进行打分,分值为1～7分(从极端不好到极端好),对4种调味料的最佳工艺条件进行探索,添加量以不同水平符号为代表(见表3)。最后以最佳的盐、糖、胡椒粉和姜蒜粉添加量来调味章鱼内脏海鲜风味基料,并加入玉米淀粉为填充剂,经过旋转蒸发、真空浓缩(0.08 MPa,温度80～90 ℃)和喷雾干燥(进风温度180～190 ℃,出风温度 80～90 ℃)后，制成味道鲜美、营养丰富的章鱼内脏海鲜调味料。

表2 “滋味”特性评分标准Table 2 Sensory of “taste” evaluation standards

表3 调味品添加量与水平代表Table 3 Additions of condiments and level representations

1.2.9 调味料理化及卫生指标测定 水分:直接干燥法,参照GB/T 5009.3-2016;总砷含量:砷斑法,参照GB/T 5009.11-2014;铅含量:二硫腙比色法,参照GB/T 5009.12-2017;菌落总数:平板计数法,参照GB4789.2-2016;大肠菌群:MPN法,参照GB4789.3-2016。

1.2.10 海鲜调味料的风味分析 将章鱼内脏海鲜调味料利用轻松感官分析系统软件,将感官评分进行风味剖面检验,分等级为1～7分[20]。

1.2.11 调味料的感官评价方法 根据标准SB/T 10485-2008 《海鲜粉调味料》,分别就“色泽”、“形态”、“香气”与“滋味”四种特性，对表3中的四个因素不同浓度盐(5%、15%、25%、35%、45%、55%)、糖(2%、6%、10%、14%、18%、22%)、胡椒粉(1%、2%、3%、4%、5%、6%)和姜蒜粉(1%、2%、3%、4%、5%、6%)来进行感官评定,各特性的最高分值的规定见表4。“滋味”特性评分与其他三种特性不同,是把评价的强度结果用等距标度计分,以七分制转化为数值,其评定标准见表2,最后将感官得分进行方差分析。在感官品评之前，首先对8名品评员进行解说和培训,评定时品评员先以康师傅鲜虾鱼板面的调味包作为参照物进行评分,再对随机编号后的实验产品进行感官评定。

表4 基于SBT 10485-2008制定的感官评价标准Table 4 Sensory evaluation criteria-based on SBT 10485-2008 standard

1.3 数据统计分析

数据采用Origin 7.0和Microsoft Excel 2007进行统计分析,数据用平均值±标准偏差(n=3)表示。方差分析方法参考[21]方差F值的计算方法,查F分布表,求F(df,dfE,α)。当F>F(dfA,dfE,α),则在显著水平α=0.05上有显著差异,否则无显著性差异。df为处理间的自由度,dfE为处理内的自由度。

2 结果与分析

2.1 酶活力的测定

胰蛋白酶的酶活力为8396.8 U/g,在有效范围内。

2.2 章鱼内脏主要成分分析

软体动物蛋白质含量一般为7%～23%[2],而由表5可见章鱼内脏中水分含量为73.8%±0.59%,蛋白质含量仅次于水分,为14.3%±0.14%,所以酶解章鱼内脏对充分利用资源,开发新产品都有十分重要的意义。

表5 章鱼内脏的基本化学成分Table 5 Basic chemical composition of octopus viscera

2.3 酶解条件的单因素实验

2.3.1 酶浓度对酶解效果的影响 由图1可以看出,水解度基本呈上升趋势,这是因为酶用量越多,更有利于底物的酶解。当酶的作用浓度为0.5%～2.0%,其上升趋势比较明显,之后变化平稳,从经济方面考虑,选取2.0%为章鱼内脏最佳酶的作用浓度,此时水解度较高,高达34.0%。与文献[22]中的研究结果一致:胰蛋白酶的水解度随酶量的增加而增加。

图1 酶浓度(E/S)对酶解效果的影响Fig.1 The effect of enzyme concentration on enzymolysis

2.3.2 酶解时间对酶解效果的影响 由图2可以看出,随着酶解时间的增加,水解度呈上升趋势,这是因为，酶作用于底物上时间越长,酶解的更加充分。当酶解时间在8.0 h以后,底物几乎消耗完毕,水解度基本不变,故选择胰蛋白酶酶解章鱼内脏的最佳时间为8.0 h,此时水解度为36.0%。

图2 酶解时间对酶解效果的影响Fig.2 The effect of time on enzymolysis

2.3.3 酶解的底物浓度对酶解效果的影响 由图3可以看出,当底物浓度为5%～10%之间时,随着酶解底物浓度的增加,水解度呈明显上升趋势,当大于10%时,水解度逐渐下降。底物浓度的大小对酶解效果的影响比较明显,浓度太大和太小都不利于水解反应的进行[23],故选取胰蛋白酶酶解章鱼内脏的最佳底物浓度为10.0%。

图3 酶解底物浓度对酶解效果的影响Fig.3 The effect of the substrate concentration on enzymolysis

2.3.4 酶解温度对酶解效果的影响 由图4可以看出,当温度为30.0～40.0 ℃之间时,随着温度的升高,水解度明显增大,在温度达到40.0 ℃以后,水解度呈下降趋势。这是因为，酶是热敏物质,当达到最适温度后会失活变性,酶解效果降低,故酶解章鱼的最佳温度条件为40.0 ℃,此时水解度为40.0%。

图4 酶解温度对酶解效果的影响Fig.4 The effect of temperature on enzymolysis

2.3.5 酶解pH对酶解效果的影响 由图5可以看出,当酶解pH在5.0～8.0之间时,随着酶解pH的升高,水解度一直上升,当酶解pH大于8时,酶解pH开始下降,这是因为，酶具有最适pH,当超过此值会失活变性，导致酶解效果下降,故酶解章鱼内脏的最佳pH为8.0,此时水解度为37.5%。pH影响酶的稳定性,改变pH大小,会影响蛋白酶分子的空间构象、与催化有关基团的解离状况、酶分子及底物的结合状态及酶-底物复合物的解离,从而影响酶解反应[24]。

图5 酶解pH对酶解效果的影响Fig.5 The effect of pH on enzymolysis

2.4 酶解条件的正交实验优化

正交设计及结果见表6,根据极差值Rj得出,A(底物浓度)>A×C(酶的作用浓度)>空白>B(温度)>B×C>C>A×B,所以只考虑前三个主要因素。虽然A因素对章鱼内脏水解度的影响最大,但A×C因素的影响大于C因素,所以只需要分析因素A×C的相互搭配,其搭配实验结果见表7。由表7可知,因素A、C之间的最好搭配是A2C2。对于B因素,通过Kij和kij值看出其最佳水平为B3。故本试验应选取的最优水平组合为A2B3C2,即本实验的最佳底物浓度为10.0%、最佳酶作用浓度(E/S)为2.5%、最佳酶解时间为40.0 ℃。

表6 章鱼内脏酶解条件正交设计及结果Table 6 Orthogonal design and the results of conditions of enzymatic hydrolysis on octopus viscera

表7 A×C搭配表Table 7 A×C cross-linkTable

2.5 海鲜调味料调味实验

对4种因素所得的感官评分进行表8的方差分析,已知对于4种因素中的6组不同浓度样品的自由度dfA为5,对于8名品评员自由度dfB则为7;处理内的自由度dfE为35。故F(dfA,dfE,α)为2.48,F(dfA,dfB,α)为2.28。由表8可得,当显著水平α=0.05时,除了盐和糖这两个添加量,品评员之间无显著差异(p>0.05)。这可能是因为盐与糖是日常常用的调味品,品评员对其味道比较习惯。其他因素都有显著性差异(p<0.05),说明各实验因素相互独立,实验误差较小,可提供一定的参考作用。其平均感官得分结果如图6,由图6可知，当盐浓度为35%(水平为3)、糖浓度为14%(水平为3)、胡椒粉浓度为3%(水平为2)和姜蒜粉浓度为4%(水平为3)时,产品比较容易被大多数人接受。

表8 方差分析Table 8 Variance analysis

图6 不同调味品添加量对章鱼内脏 海鲜调味料感官得分的影响Fig.6 Effects of different condiments on sensory scores of octopus viscera seafood seasoning

2.6 海鲜调味料的风味分析

根据风味剖面检验报告结果(见表9)及其QDA(图7)可看出,海鲜调味料综合印象较好,咸味、鲜味强烈。以市面上类似的产品康师傅鲜虾鱼板面调味包与本海鲜调味料所做的感官评价如表10对比可知,章鱼内脏海鲜调味料比康师傅鲜虾鱼板面调味包评分更高,产品具有海鲜调味料特有的色泽、香气和滋味。其水分含量为1.0%±0.78%,砷含量为(0.15±0.02) mg/kg,铅含量为(0.3±0.04) mg/kg,细菌总数<8000 CFU/g,大肠菌群<100 MPN/100 g,微生物指标和理化指标均达到SB/T 10485-2008 《海鲜粉调味料》所规定的标准。所以本产品安全又美味,与市场上主流产品媲美,可推广到市面上。

表9 章鱼内脏海鲜调味料的风味剖面检验报告Table 9 Octopus viscera seafood seasoning flavor profile inspection reports

表10 章鱼内脏海鲜调味料与康师傅鲜虾鱼板面调味包的感官得分对比Table 10 Comparison of sensory scores between octopus viscera seafood seasoning and Master Kang shrimp-fish seasoning

图7 章鱼内脏海鲜调味料的QDA图Fig.7 QDAFigure of octopus viscera seafood seasoning

3 结论

本文利用章鱼内脏加工海鲜调味料,利用胰蛋白酶对其水解,探讨了酶解最佳工艺条件、酶解液的最佳调味条件，并分析了各最佳条件下生产的海鲜调味料的风味特性,主要结论如下:

结合单因素和正交实验结果,可得出胰蛋白酶酶解章鱼内脏的最佳酶解条件为:底物浓度为10.0%、酶作用浓度(E/S)为2.5%、酶解温度为40 ℃、酶解时间为8.0 h、酶解pH为8.0。

在海鲜调味料调味方面,通过单因素实验及方差分析确定最佳的调味料的用量为:食盐35%、蔗糖14%、胡椒粉3%、姜蒜粉4%,制作出海鲜调味料无明显苦味和腥味,具有较强烈的海鲜风味,本研究不仅大大提高了章鱼下脚料的产品附加值,而且减少了环境污染,得到的章鱼内脏海鲜调味料具有营养、美味与安全等特点,具有一定的市场前景。但是在研究中还有很多的不足,蛋白水解酶较为单一,水解率较低,在后续研究中可添加复合酶以提高水解率。