响应面法优化合浦珠母贝糖胺聚糖 咀嚼片的制备工艺

张 磊,王锦旭,杨贤庆,*,魏 涯,岑剑伟

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室, 国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300; 2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

合浦珠母贝(Pinctadamartensii)又名马氏珠母贝,是我国南方海水珍珠养殖的主要品种之一,广泛分布在广东、广西和海南等沿海地区[1-2],随着海水珍珠养殖面积的不断增大,其产量逐年增加。珠农采珠后,每年所余的加工副产物珍珠贝肉约达3500～4000 t,大多为新鲜或粗加工后食用,以鲜品销售为主,价格低廉,深加工率较低、贮藏期短,导致珍珠贝肉的开发利用受到限制,造成资源的巨大浪费,采珠后产生的大量珍珠贝肉急需进行高值化利用[3]。合浦珠母贝贝肉除了富含优质蛋白质和多种矿物质之外,其中的糖胺聚糖作为一种天然来源的具有免疫调节功能的生物活性多糖也越来越引人关注。

糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs),也称氨基多糖或酸性粘多糖,是由重复的二糖单位构成的长链多糖,存在于多数海洋动物的组织中,具有增强免疫功能、抗凝血、降血糖、抗肿瘤等多种作用[4-5]。有文献证实,糖胺聚糖可通过刺激机体的各种免疫活性细胞(树突状细胞[6]、B淋巴细胞)的成熟、分化和繁殖,增加巨噬细胞非特异性细胞毒性,诱导IL-1、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-8等细胞因子的产生和细胞因子受体的表达,具有促进抗原递呈、抗体形成,活化补体系统的经典途径及变更途径等作用,备受医药界和食品界的关注[7-12]。因此,从合浦珠母贝全脏器中提取糖胺聚糖[13],开发出新型产品,实现合浦珠母贝高值化利用,可以丰富其食品种类和资源转化途径,对贝类养殖业健康持续发展和人类健康有重要意义。

咀嚼片是指于口腔中咀嚼或吮服使片溶化后吞服的片剂,服用方便,可吞服、咀嚼含吮或用水溶解后服用。片剂经嚼碎后表面积增大,可促进活性成分在体内的溶解和吸收,即使在缺水状态下,也可以保证按时服用,尤其适合老人、小孩、吞服困难及胃肠功能差的人群,具有生物利用度高[14]、减少胃肠道负担等优势,因此越来越多的营养健康食品被开发制成咀嚼片,如燕麦膳食纤维咀嚼片[15]、氨基酸螯合钙奶味咀嚼片[16]、纳豆咀嚼片[17]等。

目前关于合浦珠母贝糖胺聚糖的研究局限在制备工艺优化和对免疫器官、淋巴细胞的增殖作用等,而对其在食品工业方面的应用尚未被报道[18]。针对这种不足,本文旨在开发出糖胺聚糖系列的营养健康食品,以实验室自制的合浦珠母贝糖胺聚糖为主料,通过加入辅料制备成咀嚼片,在单因素实验的基础上,以感官评价为指标,采用响应面法试验优化出最优的配方工艺,为糖胺聚糖咀嚼片制备工艺提供了参数依据,为合浦珠母贝的充分开发提供新的方法和思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

合浦珠母贝(总重25～35 g,全脏器) 广东省徐闻县,-18 ℃保存;糖胺聚糖 自合浦珠母贝全脏器中提取,置于4 ℃条件下冷藏待用;羟丙基甲基纤维素(HPMC) 美国陶氏化学公司;微晶纤维素(MCC) 浙江省湖州展望药业有限公司;乳糖 德国Meggle公司;硬脂酸镁 上海吉天食品有限公司;柠檬酸、甘露糖、阿斯巴甜 均为食品级,广州齐云生物技术有限公司;中性蛋白酶(100 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、透析袋、DEAE-52纤维素填料 广州齐云生物技术有限公司;SD大鼠 SPF级,雌雄各半,体重180～200 g,广东省医学动物实验中心,动物生产许可证号SCXK(粤)2013-0003,实验动物质量合格证明号No. 44007200037911,动物饲养于广东省医学动物实验中心SPF级动物实验设施[许可证号SYXK(粤)2013-0002,动物实验证明号No. 00165703]。

Milli-Q超纯水机 美国Millipore公司;DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂;HWS24电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;Delta320精密pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;紫外分光光度计 日本Shimadzu公司;旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;DEAE-52纤维素阴离子柱 上海宝曼生物科技有限公司;Alpha1-4冷冻干燥机 德国Christ;DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;TDP-1单冲压片机 上海天凡药机制造厂;78X-3片剂四用测试仪 上海黄海药检仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 合浦珠母贝糖胺聚糖提取工艺 参照周小双[13]和孙晓朋[19]的方法,并稍加修改。将合浦珠母贝全脏器常温下自然解冻,用高速组织捣碎机制成肉泥备用。取一定量肉泥加2倍体积水,55 ℃浸提4 h,4 ℃浸提12 h。加入中性蛋白酶和胰蛋白酶,调节pH7.6,复合酶解4 h,煮沸10 min灭酶,10000 r/min离心20 min,取上清液,重复离心操作直至除去杂质蛋白。上清液pH调至7.0,加70%乙醇4 ℃醇沉12 h,8000 r/min离心取沉淀,对沉淀抽滤,无水乙醇、丙酮分别交替洗涤沉淀,冷冻干燥48 h得糖胺聚糖粗制品,粗多糖经过透析,DEAE-52纤维素阴离子柱层析分离得到合浦珠母贝糖胺聚糖精制品。

1.2.2 合浦珠母贝糖胺聚糖咀嚼片制备工艺 工艺流程:糖胺聚糖、辅料→过筛→制软材→造粒→干燥→整粒→加润滑剂压片→质量检测→咀嚼片。

准确称取糖胺聚糖及配方中其它辅料,过100目筛混匀后,缓慢喷洒10%的羟丙基甲基纤维素水溶液,同时不断搅拌均匀制成软材,20目筛造粒,于60 ℃干燥至含水量小于3%,加适量硬脂酸镁混匀后过16目筛整粒,确定片重,采用直径8 mm单冲压片即得糖胺聚糖咀嚼片(规格200 mg/片)。将片剂置于紫外灯下照射15～20 min,用食品级阻湿包装袋按20片每小袋的规格包装,再将小袋包装按照一定数量装成大包装[20-22]。

1.2.3 单因素实验 根据前期糖胺聚糖活性评价实验结果和成人—小鼠剂量换算公式,合浦珠母贝糖胺聚糖的小鼠起效剂量为0.25 mg/d,按照公式换算为成人起效剂量为200 mg/d,按照每天服用六片咀嚼片计算,每片中的糖胺聚糖添加量为17%[18]。实验选择甘露糖为矫味剂、MCC为填充剂、HMPC为粘合剂、硬脂酸镁为润滑剂,适量乳糖调节片重,对影响糖胺聚糖咀嚼片品质的四个主要因素,分别进行单因素试验。

矫味剂添加量的选择:在糖胺聚糖17%、填充剂40%、粘合剂3%、润滑剂2%的情况下,考察矫味剂添加量分别为15%、20%、25%、30%、35%时，对咀嚼片感官分值的影响。

填充剂添加量的选择:在糖胺聚糖17%、矫味剂20%、粘合剂3%、润滑剂2%的情况下,考察填充剂添加量分别为35%、40%、45%、50%、55%时，对咀嚼片感官分值的影响。

粘合剂添加量的选择:在糖胺聚糖17%、矫味剂20%、填充剂40%、润滑剂2%的情况下,考察粘合剂添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%时，对咀嚼片感官分值的影响。

润滑剂添加量的选择:在糖胺聚糖17%、矫味剂20%、填充剂40%、粘合剂3%的情况下,考察润滑剂添加量分别为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%时，对咀嚼片感官分值的影响。

1.2.4 响应面优化试验 根据Box-Behnken实验设计原理,建立三因素三水平的模型,运用统计分析软件Design-expert 8.0.6对数据进行处理,优化糖胺聚糖咀嚼片配方参数。基于单因素实验结果,综合考虑各因素对感官分值的影响,选取以矫味剂(A)、填充剂(B)、粘合剂(C)为自变量,自变量的水平以-1、0、1作为编码值,实验共有17组,其中包含12个析因点和5个零点,这5个零点实验用于误差估计,其因素水平编码见表1。

表1 响应面试验因素及水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiment

1.2.5 感官评价方法 由10位具有一定经验及鉴别能力的品尝者组成评定小组,依据评分标准,分别对咀嚼片的色泽、组织状态、硬度和口感4个项目进行评分,取其平均值为最终感官分值。感官评分标准见表2[23-24]。

表2 感官评分标准(分)Table 2 Sensory evaluation standards(score)

1.2.6 其他指标的测定方法 水分指标测定:采用GB 5009.3-2016中的直接干燥法对片剂的水分进行测定[25];糖胺聚糖测定:1,9-二甲基亚甲基蓝法[13];蛋白质测定:BCA试剂盒法;总糖测定:苯酚-硫酸法;重金属污染物测定:湿法消解ICP-MS;微生物指标测定:菌落总数的测定参照GB 4789.2-2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》[26],大肠菌群的测定参照GB 4789.3-2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》[27]、霉菌和酵母菌的测定参照GB 4789.15-2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母菌计数》[28]、金黄色葡萄球菌的测定参照GB 4789.10-2016《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》[29]、沙门氏菌的测定参照GB 4789.4-2016《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》[30]。

表3 急性经口毒性的评价规定Table 3 Evaluation regulations of acute oral toxicity

1.3 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 矫味剂的筛选 咀嚼片一般经口中嚼碎后咽下,因此口味的好坏至关重要,甘露醇有甜味,因溶解时吸热而使口腔有舒服感,所以选择甘露醇为咀嚼片的矫味剂[32]。从图1可知,当添加量小于25%时,随着添加量的增加,咀嚼片感官分值增加;在添加量为25%时,咀嚼片达到较适宜的爽口度和甜度,感官分值为78.3分;超过25%之后,随着添加量的增加,咀嚼片感官分值降低,此时咀嚼片爽口度虽然继续增加,但甜度开始过大。另外,矫味剂对感官分值的影响比较明显,添加量为25%与20%、30%、35%之间均存在显著性差异(p<0.05),综合考虑选择矫味剂添加量为25%。此外,采用阿斯巴甜和柠檬酸进行配伍实验,当阿斯巴甜添加量为0.5%,柠檬酸添加量为0.1%时,可以调出愉悦绵延的酸甜的口感,辅助矫味的效果更佳。

图1 矫味剂添加量对咀嚼片感官分值的影响Fig.1 Effects of additive amount of flavoring agent on sensory score of chewable Tablets

2.1.2 填充剂的筛选 在制备咀嚼片时,加入填充剂,使片剂的质量增加,体积增大,可使主料成分剂量偏差减少,解决因其用量小致压片困难的问题[33-34]。糖胺聚糖具有一定粘性,加入填充剂来分散主料,降低其粘性,更便于制粒。由预实验得知,MCC作为填充剂时,片剂成形性最好,而淀粉制得的咀嚼片难以成型,且其糊口感严重,麦芽糊精成形性介于上述两者之间[32];因此,选用MCC作为填充剂,MCC添加量对咀嚼片感官分值的影响结果见图2。由图2可知,咀嚼片感官分值随着MCC添加量的增加先缓慢升高后降低,并在添加量为45%时达到最高值,感官分值为75.0分。当添加量继续增加,制得片剂的感官分值显著降低(p<0.05),可能是由于片剂硬度增大、不易咀嚼等原因导致感官分值下降[32],故选择MCC添加量为45%。此外,需添加适量乳糖调节片重,乳糖不仅耐压性好,安全性高,而且甜度低,添加量对整个片剂的口感影响较小。

图2 填充剂添加量对咀嚼片感官分值的影响Fig.2 Effects of additive amount of filler on sensory score of chewable Tablets

2.1.3 粘合剂的筛选 湿法造粒可有效防止粉尘飞扬,也可有效提高填充效率[24]。本文选择聚乙烯吡咯烷酮、HMPC和淀粉浆进行黏合剂筛选预实验,结果显示,淀粉浆黏结效果不好、片剂入口松散;聚乙烯吡咯烷酮不溶于水,在乙醇溶液中溶解缓慢,操作复杂;HMPC口感无异味,有一定的粘合效果,宜采用[35]。实验以HPMC水溶液为粘合剂,考察不同HPMC添加量对咀嚼片感官分值的影响,结果如图3所示。由图3可知,当HPMC添加量为1%～3%时,咀嚼片感官分值有所增加，但无显著性差异(p>0.05)，当HPMC添加量为3%时,咀嚼片感官分值最高,而随着HPMC含量的降低,感官分值缓慢下降,可能是因为造出颗粒的紧密程度降低,粉剂增多,出现碎片的频率增大[24];在实际操作过程中,当添加量为3%时,制得的软材适合造粒,造出的颗粒紧密,硬度适合压片,且无碎片、裂片现象发生,这与刘明华等提出的当以HMPC为粘合剂,添加量为3%时,制得的咀嚼片圆整光洁、硬度适中、咀嚼性好的结果一致[36]。此外,当HPMC添加量高于3%时,其感官分值较添加量低于3%时的感官分值显著降低(p<0.05),因此,实验选择1%、2%、3% HPMC添加量进行后续的响应面试验。

图3 粘合剂添加量对咀嚼片感官分值的影响Fig.3 Effect of additive amount of adhesive on sensory score of chewable Tablets

2.1.4 润滑剂的筛选 在压片前,为使咀嚼片表面光滑,易从模板上脱落,需在混合后的物料中加入一定量的润滑剂,常用的疏水性润滑剂有硬脂酸镁、微分硅胶和滑石粉等。由预实验可知,硬脂酸镁作为润滑剂进行压片时,既可提高咀嚼片外观亮度,又能防止粘冲[37],因此,实验选择硬脂酸镁作为润滑剂,考察润滑剂添加量对咀嚼片感官分值的影响,结果如图4所示。由图4可知,随着硬脂酸镁添加量增加,感官分值逐渐增加,当添加量为1.0%时,感官分值为75.2分,且脱模效果好,推测是润滑剂增加了颗粒的流动性、润滑性,减少了物料的黏性[24];而当润滑剂添加量继续增加时,感官分值呈缓慢下降的趋势,这一结果与冯大伟等[24]在制备菊粉咀嚼片时，提出的当硬脂酸镁添加量为1%时，润滑效果好、片面光滑美观的实验结果相符。因此,实验选用硬脂酸镁添加量为0.5%、1.0%、1.5%进行后续的响应面实验。

图4 润滑剂添加量对咀嚼片感官分值的影响Fig.4 Effect of additive amount of lubricant on sensory score of chewable Tablets

2.2 响应面法优化咀嚼片配方结果分析

2.2.1 响应面试验设计及结果 依据响应面Box-behnken实验设计,最终完成17组试验,试验设计及结果见表4。

表4 响应面实验设计及结果Table 4 Design and results of response surface experiment

2.2.2 回归方程的建立与方差分析 运用Design-expert 8.0.6软件对表4实验数据进行回归分析,对模型进行方差分析及显著性检验,采用逐步回归的方法对设计进行优化,建立的二次响应面回归模型为:感官分值Y=78.50+0.86A-1.59B+0.63C+1.64AB-0.91AC+1.00BC-2.01A2-3.10B2-1.23C2。

表5 回归方程的方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

根据回归方程可绘制出相应的等高线和响应曲面,具体见图5～图7。所拟合的响应曲面的形状直观地反映了各因素对响应值的影响趋势,等高线的形状可反映出两变量交互作用的显著程度,椭圆形表示两因素交互作用明显,而圆形则与之相反[38]。图5是矫味剂和填充剂添加量对响应值的影响图,可以看出随着矫味剂和填充剂添加量的增加,感官分值呈先升后降的趋势,响应曲面图形陡峭,表示两因素对感官分值的影响显著,与方差分析结果吻合。由等高线图形可以看出,图5等高线呈椭圆形,表明矫味剂与填充剂的交互作用对感官分值的影响极为显著,由图6～图7等高线图形可知,矫味剂与粘合剂以及填充剂与粘合剂的交互作用对响应值的影响均不显著,这也与回归分析的结果吻合。

图5 矫味剂和填充剂添加量对咀嚼片感官分值的影响Fig.5 Effect of additive amout of flavoring agent and filler on sensory score of chewable Tablets

图6 矫味剂和粘合剂添加量对咀嚼片感官分值的影响Fig.6 Effect of additive amout of flavor agent and adhesive on sensory score of chewable Tablets

图7 填充剂和粘合剂添加量对咀嚼片感官分值的影响Fig.7 Effect of additive amout of filler and adhesive on sensory score of chewable Tablets

以感官分值为指标,经Design-expert软件分析可得到咀嚼片的最优工艺条件为:矫味剂添加量25.49%、填充剂添加量43.96%、粘合剂添加量2.13%,对应的预测值高达78.75分,虽略低于响应面结果中的79.30分,但误差小于0.7%,模型合理。为了检验模型预测的准确性,按最佳工艺稍作调整,即各组分添加量分别为糖胺聚糖17%、矫味剂25%、填充剂44%、粘合剂2%,在此条件下重复制作3个批次,感官分值为78.5±0.8分,与理论预测值相比相对误差为1.35%,说明该模型能很好地预测糖胺聚糖咀嚼片配方工艺。

2.3 糖胺聚糖咀嚼片质量指标检测结果

制得咀嚼片均重约200 mg,直径约8 mm,形状完整,根据《中国药典》(2015年版)[39]检测方法,对糖胺聚糖咀嚼片的感官、重量差异、硬度、脆碎度、重金属和微生物限度等质量指标进行,检测结果见表6。结果表明,糖胺聚糖咀嚼片质量指标检测结果均符合营养健康食品的相关要求,能有效保障产品质量[40]。

表6 糖胺聚糖咀嚼片理化指标检测结果Table 6 Physic-chemical index of glycosaminoglycan chewable Tablets

2.4 糖胺聚糖咀嚼片急性经口毒性实验结果

急性经口毒性实验是指一次或24 h内多次染毒的实验,主要测定受试物的半数致死量或浓度,并观察试验动物的中毒表现。该实验中,合浦珠母贝糖胺聚糖咀嚼片组、溶剂对照组各20只SD大鼠，在给予受试物过程及14 d观察期内,大鼠表现行为、活动状况、呼吸、姿势等均未见异常,无大鼠死亡。动物解剖后,肉眼观察大鼠的心脏、肝脏、脾、胃、肠、肾及生殖腺等脏器外形、颜色、大小与比例,均未见任何异常,大鼠脏器未发生病变。大鼠体质量正常增长,合浦珠母贝糖胺聚糖咀嚼片组的大鼠体质量在各测定时间点与溶剂对照组比较均无显著性差异(p>0.05),如表7所示。因此,在该实验条件下,合浦珠母贝糖胺聚糖咀嚼片对SD大鼠经口最大耐受剂量(MTD)高于15 g/kg,毒性分级为无毒。

表7 SD大鼠急性经口毒性实验体重结果Table 7 Results of acute oral toxicity experiments in SD rats on body weight

3 结论

合浦珠母贝糖胺聚糖咀嚼片的感官品质受矫味剂、填充剂、粘合剂及润滑剂等多种因素的影响,本文得出最佳工艺配方(以质量百分比计)为:糖胺聚糖17%,甘露醇25%,微晶纤维素44%,羟丙基甲基纤维素2%、硬脂酸镁1%,其余为乳糖,在此条件下感官分值为78.5±0.8分,与理论预测值的相对误差为1.35%,说明配方工艺具有可行性。质量指标检测结果显示,制得的白色双平面圆形片剂形状完整、表面光滑、色泽均匀一致、口感细腻,咀嚼片质量指标检测结果均符合《中国药典》和营养健康食品的相关要求。急性经口毒性实验结果表明,咀嚼片对SD大鼠经口最大耐受剂量(MTD)高于15 g/kg,毒性分级为无毒。合浦珠母贝糖胺聚糖咀嚼片质量安全、无毒副作用,不仅有助于维持人体正常的免疫功能,还有利于解决合浦珠母贝高值化利用的问题,提高低值珍珠贝肉的附加值,促进我国珍珠养殖及加工产业的持续健康发展。