金鸡毛草水提取物对2型糖尿病大鼠氧化应激及主动脉粥样硬化的影响研究*

乐 暾，牟华明△，李 晶，王 蕾，桑 俊，舒朝林

(重庆三峡中心医院：1.心血管内科；2.中心实验室 404000)

糖尿病是一种因机体糖脂代谢紊乱为主的慢性疾病，2型糖尿病占整个糖尿病群体的90%。随着社会的进步，人们生活水平的提高和生活方式的改变，2型糖尿病发病率迅速增加[1]。长期的高血糖可引起一系列改变，继而引发大量并发症，最终导致患者残疾或死亡。而大血管病变是2型糖尿病致死致残的主要原因，其主要表现是动脉粥样硬化。因此控制血糖浓度，对预防和治疗糖尿病及其并发症有重要意义。传统的中医在治疗和预防糖尿病及其并发症方面具有很大的优势，金鸡毛草(Gynura divaricata)为菊科多年生草本植物，也称白背三七、白子菜，其性凉，味甘，有清热解毒、舒筋接骨、凉血止血、散瘀消肿之功效，作为一种传统的药用植物，常用于治疗糖尿病、高血压风湿热、百日咳、臃痈疮疖等疾病[2]。研究表明[3-4]金鸡毛草水提取物具有降低血糖作用。氧化应激在糖尿病大血管病变的发生、发展过程中有重要作用[5]。本实验旨在探讨金鸡毛草水提取物对2型糖尿病大鼠机体氧化应激和大血管病变的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验药物 本实验所用药材由重庆三峡中心医院中医科郑邦本教授和重庆医科大学董志教授鉴定为菊科植物金鸡毛草。按文献[6]以10倍量水提取金鸡毛草材料2次，每次2 h过滤，合并滤液，醇沉，浓缩至2.0 g生药/mL浸膏，保存至4 ℃冰箱备用。盐酸二甲双胍片购于天方药业有限公司(批号：161209123)。

1.1.2实验动物 选取SPF级SD雄性大鼠，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(渝)2012-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(渝)2012-0001。所有大鼠均在重庆医科大学动物实验中心SPF级屏障系统饲养，自由摄食饮水，环境安静。

1.1.3饲料 高脂高糖饲料(10%猪油、20%蔗糖、2.5%蛋黄，67.5%基础饲料)、普通饲料均由北京市科澳协力饲料有限公司提供。

1.1.4试剂 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购自美国Sigma 公司(批号：10120791)，柠檬酸、柠檬酸钠、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，胰岛素(INS)试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司(批号：201702)。

1.1.5主要仪器 瑞特血糖仪(华广生技股份有限公司，型号：GM300)及配套血糖试纸；COBAS INREGRA 800全自动生化分析仪(瑞士罗氏公司)；400c型低速医用离心机(北京白洋医疗器械有限公司)；Thermo Fisher 1510酶标仪(美国)；UV-5200PC型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；1-14ED切片机(德国Thermo Electron LED GMBH)。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立 根据文献[7-8]方法，选取100只80～100 g体质量SD雄性大鼠适应性喂养3 d，自由进食、饮水。选取10只大鼠作为空白对照组，给予普通饲料喂养，其余90只大鼠予以高脂高糖饲料喂养4周，所有大鼠禁食不禁水12 h。按40 mg/kg体质量的剂量一次性腹腔注射1%STZ液(低温、避光配置，现配现用，30 min内使用完)造模，空白对照组给予等剂量柠檬酸缓冲液腹腔注射。3 d后大鼠尾静脉采血，测空腹血糖，选取血糖大于或等于16.7 mmol/L[3,7]，并出现多饮、多食、多尿的大鼠进行后续实验。空白对照组大鼠继续以普通饲料喂养，造模大鼠继续高脂高糖喂养4周，期间每周尾静脉采血测1次血糖，剔除血糖低于16.7 mmol/L的造模大鼠以确保2型糖尿病大鼠模型稳定性。

1.2.2分组与给药 选取成功造模的50只2型糖尿病模型大鼠分为5组，模型组、金鸡毛草水提取物组(16、8、4 g生药/kg)和二甲双胍组(0.2 g/kg)。空白对照组及模型组分别予以等体积生理盐水，其余组给予不同剂量金鸡毛草水提取物和二甲双胍灌胃，每天给药1次，连续4周。每周日测1次大鼠体质量(计算灌胃药物量)和血糖。

1.2.3标本收集及检测 实验末期，所有大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，颈总动脉插管取血10 mL，放入抗凝管中，经3 500 r/min离心15 min，分离血清备检。通过生化分析仪检测大鼠血脂；按照试剂盒说明书操作方法采用ELISA法检测INS，羟胺法、TBA法在紫外可见分光光度剂550 nm、532 nm测定吸光度，并计算T-SOD、MDA水平；按照试剂盒说明书用紫外可见光光度计412 nm测定吸光度并计算GSH-Px。留取胸主动脉，予以10%甲醛固定，经洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片处理后，进行HE染色，通过光学显微镜观察主动脉组织病理形态学改变并照相。

2 结 果

2.1金鸡毛草水提取物对2型糖尿病大鼠血糖的影响 金鸡毛草水提取物各组、二甲双胍组、模型组大鼠血糖与空白对照组比较，均明显升高(P<0.01)；金鸡毛草水提取物各组起效时间较二甲双胍慢，灌胃14 d后开始起效(P<0.05)，其降糖作用呈剂量依赖性增加，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2金鸡毛草水提取物对2型糖尿病大鼠血脂、血清INS的影响 与空白对照组比较，模型组胆固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、胰岛素(INS)水平均升高(P<0.05)；金鸡毛草水提取物各组及二甲双胍组CHOL、TG、HDL-C、INS水平与模型组比较均明显下降(P<0.01)；金鸡毛草水提取物各组与二甲双胍组比较，均有降低血脂的作用，差异无统计学意义(P>0.05)；对INS水平均有降低作用，但效果较二甲双胍组明显(P<0.01)，见表2。

表1 金鸡毛草水提取物对2型糖尿病大鼠血糖的影响

a:P<0.01，与空白对照组比较；b:P<0.05，c:P<0.01，与模型组比较

表2 金鸡毛草水提取物对2型糖尿病大鼠血脂、INS的影响

a:P<0.01，与空白对照组比较；b:P<0.05，c:P<0.01，与模型组比较；d:P<0.01,与二甲双胍组比较

表3 金鸡毛草水提取物对2型糖尿病大鼠血清MDA、T-SOD、GSH-PX的影响

a:P<0.01，b:P<0.05，与空白对照组比较；c:P<0.01，与模型组比较；d:P<0.01,与二甲双胍组比较

A:空白对照组；B:模型组；C:金鸡毛草水提取物高剂量组；D:金鸡毛草水提取物中剂量组；E:金鸡毛草水提取物低剂量组；F:二甲双胍组

2.3金鸡毛草水提取物对2型糖尿病大鼠血清MDA、T-SOD、GSH-PX水平的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠血清MDA水平增高(P<0.01),T-SOD、GSH-PX水平下降(P<0.05)。金鸡毛草水提取物各组、二甲双胍组MDA水平较模型组明显下降(P<0.01)。与二甲双胍组比较，金鸡毛草水提取物高剂量组MDA水平降低(P<0.05)，中、低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。金鸡毛草水提取物各组、二甲双胍组T-SOD、GSH-Px较模型组明显增高(P<0.01)；金鸡毛草水提取物各组T-SOD水平与二甲双胍组比较差异无统计学意义(P>0.05)；金鸡毛草水提取物高剂量组GSH-Px较二甲双胍组增高(P<0.01)，中、低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.4主动脉病理变化 模型组大鼠动脉有动脉硬化，但是动脉硬化程度不重，偶可见泡沫细胞。金鸡毛草水提取物各组、二甲双胍组动脉硬化病理变化均不明显，与空白对照组比较变化不大，血管内皮细胞基本完整，未见明显泡沫细胞，见图1。

3 讨 论

氧化应激是2型糖尿病并发症血管病变发展的基础。正常生理状态下，体内不断产生活性氧代谢产物(ROS)，并被细胞内外的抗氧化系统清除，保持平衡，不会造成氧化损伤；如果ROS的产生和抗氧化防御之间明显不平衡，就会引起细胞的破坏和损伤[9-10]。高血糖通过葡萄糖自身氧化和随之产生的糖基化终末产物诱导氧化应激，糖尿病时机体处于明显的氧化应激状态。本研究显示，模型大鼠血糖、血脂、INS水平较空白对照组增高，存在多饮、多食、多尿及胰岛素抵抗，故而证实为2型糖尿病模型。

MDA是体内脂质过氧化典型的分解产物，间接反映机体细胞受氧自由基攻击的程度[11]。同时脂质过氧化是动脉粥样硬化形成的关键因素[12]，其水平可随动脉粥样硬化程度而增加。本研究结果显示，模型组与空白对照组比较，MDA明显升高，说明糖尿病机体氧化应激水平是明显增高的；金鸡毛草水提取物治疗后，各治疗组与模型组比较MDA均明显降低(P<0.01)，并且金鸡毛草高、低剂量组治疗有差异(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组MDA水平下降(P<0.05)，与金鸡毛草低剂量组效果大致相同。说明金鸡毛草水提取物及二甲双胍均可减轻体内脂质过氧化和氧化应激对血管的损伤，降低机体氧化应激水平及血管动脉粥样硬化风险，并随药物剂量的增加而增强。本研究结果显示，模型组与空白对照组比较T-SOD、GSH-Px水平明显下降，经金鸡毛草水提取物及二甲双胍治疗后，T-SOD、GSH-Px水平升高(P<0.01)。T-SOD能清除体内超氧阴离子自由基，GSH-Px 是机体内一种重要的过氧化物分解酶[13]，SOD、GSH-Px是反映机体清除氧化自由的能力，机体抗氧化损伤的重要屏障。研究表明[14]，SOD促进过多的脂质在体内经分解途径而被氧化，从而减轻了过氧化物对动脉壁的直接损伤作用，较好地保护了内皮细胞的完整性，在一定程度上抑制了动脉粥样硬化的发生及减轻了病变的程度。GSH-Px存在于几乎所有的活细胞中，也被认为是细胞水平上氧化还原失衡的生物标志物,它能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能。本研究结果说明金鸡毛草水提取物具有清除自由基的功能，提高机体抗氧化能力；同样，本研究显示二甲双胍也具有清除自由基，抗氧化能力，这种机制可能与降低血糖关系密切。但金鸡毛草水提取物各治疗组增高T-SOD、GSH-Px的能力不同，剂量越大，抗氧化能力越强。

多数研究证实[13,15]，2型糖尿病血管病变与氧化应激密切相关，是血管动脉粥样硬化发生、发展的关键，并可以通过降低机体氧化应激水平，降低脂质过氧化，提高机体抗氧化能力，增强机体氧自由基清除，减轻氧化应激对血管的损伤，进而达到保护作用。本研究血管标本病理结果证实，金鸡毛草水提取物组及二甲双胍组较模型组大鼠血管动脉粥样硬化程度减轻，但各组标本血管动脉粥样硬化程度均不明显，这可能是因血管病变处于初期，模型时间不足等原因造成，有待进一步实验继续研究。

二甲双胍在临床上作为2型糖尿病一线用药，其疗效得到临床肯定。金鸡毛草水提取物各组降血糖起效较二甲双胍组慢，但实验末期最终结果比较无明显差异，说明金鸡毛草水提取物对2型糖尿病有降血糖的作用，与文献[3-4]研究一致。金鸡毛草水提取物组改善胰岛素抵抗水平及其抗氧化能力与二甲双胍组有一定差异，但不明显，亦说明金鸡毛草水提取物有改善胰岛素抵抗水平及其抗氧化能力。

综上所述，金鸡毛草水提取物可改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱，降低氧化应激水平，提高抗氧化应激能力，对2型糖尿病模型大鼠大血管病变起到保护作用。由于实验时间有限，仍需进行反复实验为临床提供更好的理论依据，并需从更多方面进行进一步深入研究。