rhGM—CSF与胰岛素联合应用对糖尿病大鼠烫伤创面TGF—β1和FGF—2表达的影响

张春月 廖毅

[摘要]目的：擬通过检测分析局部联合应用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor， rhGM-CSF）和胰岛素对糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面中转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1， TGF-β1）、碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor-2， FGF-2）以及CD34表达的影响，初步探讨局部联合应用rhGM-CSF和胰岛素促进糖尿病难愈性创面愈合的可能作用机制。方法：雄性SD大鼠制备糖尿病深Ⅱ度烫伤模型，随机分为糖尿病对照组、胰岛素用药组、rhGM-CSF用药组以及联合用药组，同时建立正常对照组。分别于伤后1、3、7、11、15、21d计算创面愈合率，观察创面组织形态学情况，并检测创面中TGF-β1、FGF-2以及CD34的表达情况。结果：伤后7、11、15、21d，正常对照组、联合用药组创面愈合率均高于其余各组，糖尿病对照组创面愈合率均低于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）。伤后3～21d，正常对照组、联合用药组TGF-β1、FGF-2表达均显著高于其余各组，糖尿病对照组最低，差异有统计学意义（P<0.05）。伤后7～21d，正常对照组、联合用药组CD34表达均高于其余各组，各时间点糖尿病对照组最低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：局部联合应用rhGM-CSF和胰岛素可通过促进糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面血管化、纤维化和上皮化，明显促进创面愈合，提高创面愈合质量，其机制可能与二者联合上调创面中TGF-β1、FGF-2以及CD34的表达有关。

[关键词]糖尿病；烫伤；GM-CSF；胰岛素；TGF-β1；FGF-2

[中图分类号]R587.1 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）06-0045-06

Abstract： Objective To analyze the influence of local application of rhGM-CSF combine with insulin on the expression of TGF-β1， FGF-2 and CD34 in wound healing with Ⅱ degree scald in diabetic rats and explore the possible mechanisms. Methods After Male Sprague-dawley rats were induced diabetic depth Ⅱ scald models， they were randomly divided into the diabetic control group， the insulin group， the rhGM-CSF group and the rhGM-CSF mixed insulin group， while the normal control group were established. The wound area was measured in 1， 3， 7， 14 and 21 days after scald to calculate the rate of wound healing. Morphology of skin tissues of wounds were observed， while the expression of TGF-β1，FGF-2 and CD34 in wound tissues were detected at each time piont. Results Compared to other groups， the normal control group and the rhGM-CSF mixed insulin group had higher rates of wound healing， while the diabetic control group had lower rates of wound healing with significant difference in 7，11，15 and 21 days after scald（P<0.05）. 3-21d after the injury， the expression of TGF-β1 and FGF-2 were significant higher in the normal control group and the rhGM-CSF mixed insulin group than those in other groups， while they were lowest in the diabetic control group （P<0.05）. 7-21d after the injury， the expression of CD34 were higher in the normal control group and the rhGM-CSF mixed insulin group than those in other groups， while they were lowest in the diabetic control group at each time point（P<0.05）. Conclusion Topical application of rhGM-CSF combine with insulin can promote angiogenesis， collagen deposition， epithelialization， and significantly accelerate wound healing with Ⅱ degree deep scald and improve the quality of the wound healing. The mechanism may be associated with upregulation of TGF-β1， FGF-2 and CD34 expression.

Key words： diabetes； scald； GM-CSF； insulin； TGF-β1； FGF-2

我国糖尿病的发病率逐年升高，糖尿病难愈性创面等慢性并发症的致残率、致死率也不断上升，严重威胁人民的健康。同时，我国每年用于糖尿病及其并发症的医疗费用超过200亿[1]，给社会、国家以及患者个人带来了巨大的经济负担。但目前国内外尚缺乏糖尿病创面难愈的明确的发病机理及有效的治疗手段，因此，寻找行之有效的糖尿病创面促愈方法刻不容缓。近年来，胰岛素联合生长因子治疗糖尿病难愈性创面的科学及临床实验备受关注，但目前对于局部联合应用rhGM-CSF与胰岛素对糖尿病大鼠烫伤创面愈合影响的报道尚不多见。马恬实验证实[2]，较单独外用胰岛素或rhGM-CSF，二者联合使用能更有效地促进坏死组织脱落、调控炎症反应从而改善创面愈合情况，加速糖尿病足难愈性创面愈合，但尚未就其中具体的作用机制展开研究。本实验以糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面为研究对象，检测联合应用rhGM-CSF和胰岛素后创面中TGF-β1、FGF-2以及CD34表达水平的变化，初步探讨局部联合应用rhGM-CSF和胰岛素对糖尿病难愈性创面产生促愈合作用的可能机制，为二者联合治疗糖尿病难愈创面提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器：SPF級雄性SD大鼠100只，体重250～350g，由西南医科大学实验动物中心提供。链脲佐菌素（streptozotocin STZ，Sigma公司，美国）；胰岛素诺和灵30R（40U/ml，诺和诺德公司，丹麦）；外用重组人粒细胞刺激因子凝胶（rhGM-CSF，100μg/10g，长春金赛公司，中国）；快速血糖检测仪（北京怡成生物电子技术有限公司）；TGF-β1、FGF-2抗体（abcam公司，英国，ab64715、ab8880）；CD34抗体（博士德公司，中国，BA0532）；SP试剂盒；Image Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 糖尿病模型制备：造模前检测大鼠尾静脉血糖值均<8.9mmol/L，适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（n=15）及糖尿病模型组（n=85），后者禁食不禁水12h，单剂量腹腔快速注射1% STZ（55mg/kg）[3]。72h后检测尾静脉血糖，若随机血糖值>16.7mmol/L，且随机抽样的胰腺经病理证实胰岛细胞被破坏（见图1），即可视为I型糖尿病模型诱导成功。不达标者3d后以10～15mg/kg补充腹腔注射STZ。正常对照组腹腔注射相同剂量的柠檬酸缓冲液。

1.2.2 深Ⅱ度烫伤模型制备及分组：糖尿病模型组大鼠血糖稳定4周后，各组大鼠以戊巴比妥钠麻醉，背部脱毛。次日麻醉后用自制烫伤装置（保持致伤温度100℃）制备2个直径约2.5cm的圆形深Ⅱ度烫伤[4]。根据预实验，正常大鼠烫伤时间为10s，糖尿病大鼠烫伤时间为8s。伤后予以10ml乳酸钠林格液腹腔注射抗休克，单笼饲养，不限制饮食。85只糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤模型中有69只造模成功，随机选取其中的60只并分为糖尿病对照组、胰岛素用药组、rhGM-CSF用药组以及联合用药组。

1.2.3 药物治疗：于伤后第1天开始，每日予以创面换药1次，直至实验结束（伤后第21天）。正常对照组、糖尿病对照组以浸有5ml生理盐水的3层纱布湿敷；胰岛素用药组以浸有5U诺和灵30R+5ml生理盐水的3层纱布湿敷；rhGM-CSF用药组浸有25μg rhGM-CSF+5ml生理盐水的3层纱布湿敷；联合用药组联合胰岛素用药组和rhGM-CSF用药组处理；各组均再用1层油纱外敷。同时，皮下注射诺和灵30R将胰岛素用药组、rhGM-CSF用药组以及联合用药组的血糖控制至正常对照组水平。

1.3 观察指标

1.3.1 创面愈合率：分别于烫伤后1、7、11、15、21d，创面未采取任何干预措施前采取图像，使用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算创面愈合率。创面愈合率=初始创面面积-观察日创面面积/初始创面面积×100%。初始创面面积=лR2 =л（2.5/2）cm2。

1.3.2 组织学观察：分别于伤后3、7、11、15、21d，各组随机选取3只大鼠，剪取创面及创周2mm全层皮肤，以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片。取部分切片行HE染色及Masson染色，光镜下观察创面组织的炎症细胞浸润，血管、胶原及上皮形成等情况。

1.3.3 TGF-β1、FGF-2以及新生血管指标CD34的表达：每个样本取6张切片，按试剂盒说明书进行免疫组化SP法染色，光镜观察，以胞浆或/和胞核着棕黄色者为阳性染色。高倍镜下（200×）每张切片任选3个视野，分别计数视野中的TGF-β1、FGF-2以及CD34的阳性细胞数，取3×2个视野计数之和分别作为TGF-β1、FGF-2以及CD34阳性表达的相对含量。

1.4 统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK检验法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况：本次成功制备糖尿病大鼠模型，胰岛细胞被破坏（见图1）。造模成功后，5组共75只大鼠均存活至实验结束，全部进入结果分析。

2.2 创面愈合率：伤后7、11、15、21d，正常对照组、联合用药组创面愈合率均高于其余各组，糖尿病对照组创面愈合率均低于其余各组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 组织学观察

2.3.1 HE染色结果：伤后第3天，各组大鼠皮肤表皮及真皮乳头层破坏，部分真皮网状层可见残存的皮肤附件，皮下组织结构紊乱，胶原纤维变性坏死，细胞崩解，伴炎性细胞浸润；其中联合用药组炎性细胞浸润最为显著，糖尿病对照组最少。

第7天，各组炎性细胞浸润均较前明显增加，同时可见新生肉芽组织形成；糖尿病对照组可见少量成纤维细胞及内皮细胞；胰岛素用药组、rhGM-CSF用药组可见较多成纤维细胞，内皮细胞逐渐增多，形成毛細血管；正常对照组、联合用药组新生肉芽组织中可见更多的成纤维细胞以及毛细血管，同时可见部分基底细胞增殖。

第11～15天，除糖尿病对照组炎性细胞浸润继续较前显著增加外，其余各组炎性细胞浸润较前均有不同程度的减少。糖尿病对照组成纤维细胞逐渐增加，出现少量新生毛细血管；其余各组成纤维细胞增生更为明显且逐渐成熟为纤维细胞，伴红色胶原形成，毛细血管继续增加，且部分毛细血管管壁增厚，基底细胞增生形成的皮岛逐渐增多融合，形成薄层上皮，以正常对照组、联合用药组为甚，胰岛素用药组、rhGM-CSF用药组次之（见图2）。

第21天，糖尿病对照组仍有较多肉芽组织及炎性细胞，被覆不连续的薄层上皮，其余各组炎性细胞浸润减少。rhGM-CSF用药组、胰岛素用药组大部分创面被覆新生复层上皮，但其结构尚不完整；正常对照组、联合用药组创面已基本上皮化，表皮结构较完整。

2.3.2 Masson染色结果：伤后第3天，各组大鼠创面组织中胶原断裂，纤维纤细、稀疏，排列及其紊乱，尤以糖尿病对照组为甚。第7天，糖尿病对照组胶原纤维仍较纤细、稀疏、紊乱；胰岛素用药组、rhGM-CSF用药组胶原纤维较前致密，但仍紊乱；正常对照组、联合用药组胶原纤维相对粗大、致密、规整，但正常对照组不及联合用药组。第11～15天，各组胶原纤维逐渐增多并融合形成粗大的纤维束，排列也逐渐趋于均匀、规整，尤以联合用药组为甚，正常对照组次之，糖尿病对照组最差（见图3）。第21天，各组创面真皮及真皮下胶原束较前粗大、致密，同时正常对照组、联合用药组胶原束排列最为规整，大部分平行于表皮，胰岛素用药组、rhGM-CSF用药组次之，糖尿病对照组最差。

2.4 免疫组织化学检测结果：伤后3～21d，正常对照组、联合用药组TGF-β1、FGF-2表达均显著高于其余各组，糖尿病对照组最低，差异有统计学意义（P<0.05），各组均于第15天达到峰值。见表2～3，图4～5。

伤后第3天，正常对照组、胰岛素用药组、rhGM-CSF用药组、联合用药组CD34表达，差异无统计学意义（P>0.05），其余时间点正常对照组、联合用药组CD34表达均高于其余各组，各时间点糖尿病对照组最低，差异有统计学意义（P<0.05），各组均于第21天达到最高观察值。见表4，图6。

3 讨论

糖尿病创面难愈并非单因素作用的结果，除了血管病变、神经病变、感染因素外，糖代谢重构的产物所介导的创面修复细胞、细胞外基质、细胞因子的生物学异常可能是糖尿病创面难愈的重要因素[5]。在创面愈合这个复杂的调控网络中，生长因子作为其中的“枢纽”，发挥着至关重要的作用。

GM-CSF是参与创面愈合过程的一种多功能生长因子，大量研究表明，局部应用GM-CSF可安全、有效地治疗多种原因导致的急、慢性创面。研究表明[6-7]GM-CSF基因敲除小鼠创面愈合明显延迟，而外用GM-CSF能刺激内皮细胞增殖、分化，增加肉芽组织中微血管的密度，并促进其成熟、稳定。刘继松等[8]研究证实，GM-CSF能促进创面早期炎症细胞浸润并介导其释放NE、MMP-1、MMP-9，加速创面溶痂。另有研究提示[9-10]，GM-CSF可通过介导Akt/mTOR通路刺激糖尿病创面中成纤维细胞增殖，胶原纤维沉积以及再上皮化。在创面修复后期，rhGM-CSF可促进毛囊再生，并通过调节创面TGF-β的表达，促进肉芽组织及新生组织中胶原纤维的可控性沉积，从而提高创面愈合质量[11-13]。

近年研究发现，除了调节能量代谢及蛋白质合成之外，胰岛素还参与调控创面修复细胞、细胞生长因子及细胞外基质，提示其对创面修复起到积极作用。研究报道[14]，胰岛素可加速血管新生，可能与其促进胰岛素受体及PI3K/Akt通路介导的内皮细胞迁移及血管管腔形成有关。Apikoglu-Rabus等[15]通过动物实验发现，胰岛素可通过调节创面组织中成纤维细胞的生物学活动，促进胶原纤维的合成。另有研究表明[16]，胰岛素可通过促进创面细胞因子表达、胶原纤维合成等间接作用，以及对创面修复细胞如炎症细胞、角质形成细胞的直接作用促进糖尿病创面愈合。此外，局部应用胰岛素可逆转糖尿病创面中胰岛素信号传导的衰减，增加eNOS，VEGF以及SDF-1α等蛋白的表达，从而促进糖尿病创面愈合[17]。

本实验研究结果表明，糖尿病大鼠创面炎症细胞浸润延迟且持续时间长，血管、胶原形成受阻，新生表皮薄弱且向创面中央爬行缓慢；与正常大鼠比较，其创面愈合时间延长，创面愈合率降低。而创面局部单独应用rhGM-CSF或者胰岛素后，创面组织中成纤维细胞及新生血管增多，新生胶原密度增加、分布均匀且排列规整，上皮爬行速度加快且新生表皮增厚，且二者联合使用后效果更为显著。相关研究表明[9]，在糖尿病大鼠创面局部使用rhGM-CSF能加速创面闭合，促进新血管生成，诱导胶原合成，提高生长因子FGF-2，TGF-β以及VEGF的水平从而促进糖尿病创面愈合。通过本实验可以观察到，自伤后第3天开始，各组TGF-β1、FGF-2及CD34表达均有升高，与糖尿病对照组相比，伤后各时间点胰岛素用药组及rhGM-CSF用药组TGF-β1、FGF-2及CD34表达均增加，而两者联合使用后创面中TGF-β1、FGF-2及CD34表达增加更为显著，创面愈合率亦明显升高。表明rhGM-CSF和胰岛素糖尿病合并烫伤创面愈合中，起到了协同促进的作用。

TGF-β1也是目前创面愈合必不可少的生长因子之一，其作用贯穿创面愈合的始终。首先，TGF-β1对巨噬细胞有趋化、活化作用，并促进其合成分泌与创面愈合相关的炎性介质[18]；其次，TGF-β1作用于成纤维细胞，一方面刺激其迁移、增殖，促进胶原的合成；另一方面诱导其向肌成纤维细胞转化，促进胶原沉积及创面收缩[19]。再次，TGF-β1可诱导新生血管以及肉芽组织形成[20]。此外，TGF-β1可刺激上皮细胞增殖并促进其向创面床迁移，加速再上皮化进程[21]。

FGF-2已被证实参与创面愈合过程，局部FGF-2的下调及活性降低与糖尿病创面难愈有关[22]。FGF-2促进创面愈合可能通过了多种环节，包括活化创面修复细胞并促进其分裂、增殖、趋化[22]；改善细胞外基质的合成；促进血管新生，加速再上皮化[19]。有文献报道，FGF-2还可作用于MMP-1，通过上调其表达调节创面中胶原蛋白含量，有效抑制瘢痕组织形成[23]。

本次实验研究结果显示，糖尿病烫伤创面愈合中，联合应用rhGM-CSF和胰岛素可发挥各自的优势，协同强化生物效应，共同促进创面愈合。胰岛素降低糖尿病创面中组织细胞的血糖水平，改善创面局部的微环境，抑制糖尿病皮肤的生物学异常，同时rhGM-CSF和胰岛素均可上调创面中TGF-β1、FGF-2及CD34的表达，调控创面炎症反应，促进新生血管形成、胶原合成及沉积、再上皮化进程从而加速创面愈合并提高创面愈合质量。本实验为rhGM-CSF和胰岛素在糖尿病难愈性创面的应用提供了新的实验依据。糖基化终末产物（Advancede glycation endproducts，AGEs）是长期高糖环境下发生非酶促糖基化反应的直接产物，可直接或间接作用于组织细胞，引发组织细胞的代谢异常，是糖尿病皮肤发生“隐形损害”的“始作俑者”之一。有文献报道[5，24]，糖尿病大鼠皮肤在高糖的长期作用下，AGEs也可作用于FGF-2、表皮生长因子受体（EGFR），阻断其介导的信号转导，抑制创面愈合。但参与创面愈合的其他细胞生长因子，如GM-CSF、TGF-β及其受体是否也发生糖基化改变以及胰岛素、rhGM-CSF可否抑制FGF-2、TGF-β及其受体的糖基化反应而促进糖尿病创面愈合，有待进一步研究。

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[收稿日期]2018-05-09 [修回日期]2018-06-02

编辑/朱婉蓉