不同酵母多糖对蛇龙珠干红葡萄酒品质的影响

尹宁宁 ， 许引虎 ， 李 敏 ， 韩舜愈 ， 王 婧 *

（1.甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃 兰州 730070；3.安琪酵母股份有限公司 ，湖北 宜昌 443003）

1 材料与方法

1.1 材料

酿酒酵母：酿酒酵母Fermicru VR5，购自荷兰DSM Food Specialties公司；蛇龙珠葡萄品种：来自甘肃民勤酿酒葡萄种植基地；酵母多糖、非活性酵母、酵母葡聚糖、酵母甘露聚糖：由安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 主要试剂

2-辛醇：色谱纯，SIGMA-ALDRICH（上海）贸易有限公司；福林酚显色剂：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖：天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；碳酸钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；偏重亚硫酸钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；均为分析纯。

1.3 主要仪器

CP214型电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司；GZX-GF101-Ⅱ电热恒温鼓风干燥器：北京科伟永兴仪器有限公司；Genesis 10s紫外-可见分光光度计：美国Thermo Scientific公司；18100摩尔超纯水机：上海摩勒科学仪器有限公司；TG-WAX气相色谱柱：美国Thermo Scientific公司；TRACE1310-ISQ气相色谱质谱仪：美国Thermo Scientific公司。

1.4 试验方法

1.4.1 酵母多糖的添加 酵母多糖在苹-乳发酵之后陈酿前进行添加，设置3种酵母多糖的不同添加量（0.15、0.3、0.45、0.6 g/L），并设平行与空白对照。具体操作工艺如下：

酵母多糖是源于酵母细胞壁或酵母中的大分子多糖复合物，主要由β-葡聚糖、甘露聚糖和少量几丁质组成[1]。这些大分子糖质胶体可以增强葡萄酒中蛋白质和酒石的稳定性，均衡葡萄酒组分，增加其圆润感和后味，增强葡萄酒香气的复杂性[2]。目前在葡萄酒酿造工艺中的带酒泥陈酿就是为了利用酵母自溶释放出的酵母多糖来改善葡萄酒的品质，然而酵母多糖在酒泥陈酿过程中释放太慢，使得该方法成本高、时间长并存在其他质量风险[2]。因此，如何利用商业酵母多糖产品，建立一种方便、快捷、安全的方法来提高干红葡萄酒的品质十分必要。

国外在20世纪末就开始对葡萄酒中的多糖来源以及作用进行了研究。SaucierS等[3]人研究发现，酿造过程中加入酵母多糖后赤霞珠葡萄酒较未加入多糖的葡萄酒圆润感及单宁的细腻感明显增加。Vernhet.V等[4]研究发现，阿拉伯半乳聚糖和甘露糖蛋白能够同酒石晶核结合，阻碍其增长，维持酒体的稳定性。Guadalupe.Z等[5]研究表明，甘露糖蛋白可以与葡萄酒中的单宁反应，降低葡萄酒的苦涩感，增加其圆润感。近几年，国内也有学者对葡萄酒中的多糖来源以及作用进行了研究。李华[6]研究显示，甘露糖蛋白可以提高葡萄酒香气的馥郁性。许引虎等[7]研究表明，酵母多糖能显著改善葡萄酒的酒体结构，增加饱满度、均衡酒体、提高色素稳定性、降低单宁的粗糙感和葡萄酒的生青味。

目前，葡萄酒工业中普遍使用带酒泥陈酿的方法来增加葡萄酒中酵母多糖的含量，然而，在陈酿过程中酵母的自溶过程在一定程度上具有不可控性，并且如果处置不当会造成葡萄酒的生青味突出，加剧葡萄酒的氧化，导致有害微生物滋生[8]。因此，如何利用商业酵母多糖的添加来代替酒泥陈酿是提高葡萄酒品质的研究方向之一，而且该技术在蛇龙珠干红葡萄酒上的应用研究尚未见报道。

作者以3种不同的酵母多糖为研究对象，分析其对蛇龙珠干红葡萄酒理化指标、香气物质成分及感官品质的影响，旨在为酵母多糖在干红葡萄酒中的开发应用提供理论依据。

葡萄原料→筛选、除梗、破碎→加入SO2、果胶酶→浸渍→加酵母菌VR→酒精发酵→皮渣分离→苹-乳发酵→换桶、过滤→陈酿（加入酵母多糖）→陈酿60 d后检测。

1.4.2 基本理化指标的的测定

1）总酸：参照GB/T 15038-2006方法，略作修改。2 mL酒样加入50 mL蒸馏水，滴入2滴酚酞指示剂混匀，NaOH标准溶液滴定，滴定至30 s不变色。记录体积V1，计算公式如下：

式中，X为样品中酸质量浓度g/L；c为NaOH浓度mol/L；V0为空白实验溶液的体积；V1为NaOH标准溶液消耗的体积；V2为酒样的体积。

2）柔和指数：计算公式如下[9]

式中，S为酒样柔和指数；A为酒精度，单位%（v/v）；T为单宁质量浓度，单位g/L；C为总酸质量浓度，单位g/L。

3）色度色调：参照李素岳[10]的方法。准确吸取酒样1 mL，用蒸馏水定容至10 mL容量瓶中，取稀释后的酒样于1 cm光程比色皿中，分别在420、520、620 nm下测定吸光度值，三者之和即为该酒样的色度值，前两者吸光度值之比即为色调值。

4）单宁：参照崔日宝[11]方法，略作修改。以一水合没食子酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到单宁标准曲线方程。吸取1 mL酒样，定容至100 mL。然后吸取1 mL样品溶液分别加入蒸馏水 5 mL，FC显色剂 （1 mol/L）1 mL和7.5%碳酸钠溶液3 mL显色。静置2 h后，在765 nm波长下测定样品的吸光度，再根据标准曲线方程计算出样品中单宁的质量浓度。计算公式如下：

式中，ρ为测定样中一水合没食子酸的质量浓度，单位为μg/mL；10为测定样定容体积，单位为mL；A为样品稀释倍数；V为酒样体积，单位为mL。

5）总花色苷：pH示差法[12]。吸取葡萄酒酒样0.5 mL，用pH 1.0缓冲液定容至10 mL。室温平衡100 min后，以蒸馏水为空白，分别在521 nm处和700 nm处测定吸光值。用同样的方法测定样品在pH 4.5缓冲溶液中的吸光度值。利用公式进行计算：

式 中 ，A=（Aλmax-A700nm）pH1-（Aλmax-A700nm）pH4.5；MW=493.2 g/mol（锦葵色素-3-葡萄糖苷）；DF为稀释倍数；1=光程的厘米数；ε=28 000摩尔消光系数。

1.4.3 香气物质检测

1）香气物质提取：取5 mL酒样，置于15 mL的样品瓶中，分别加入1.5 g NaCl和50 μL内标物2-辛醇，放入搅拌转子后用瓶塞密封，置于磁力搅拌器上30 min，室温条件下萃取30 min。

2）色谱条件：初温40℃保持5 min，以3℃/min升至180℃保持5 min，进样口温度250℃，FID检测器温度280℃，载气流速1 mL/min，GC运行时间57 min。

3）质谱条件：电子电离源（electron inoization，EI），电离源能量70 eV，传输杆温度180℃，离子源温度240℃，质量扫描范围m/z为50～350。

4）定性定量方法：定性：香气成分利用 MS全离子扫描模式下的总离子流图谱，依据色谱保留时间和质谱信息、NIST08标准谱库比对结果以及参考相关文献相结合的方法进行定性分析[13-15]。定量：采用内标法进行定量分析，内标物选用2-辛醇。

1.4.4 感官评定 感官分析根据 （González-Sanjosé，Ortega-Heras，and Pérez-Magariéo 2009）描述的方法略有调整[16-17]。使用7分结构化数值尺度来量化，1代表没有感觉，7代表感觉非常强烈。感官评价在作者所在学院标准品尝室中进行，并选择8名经过专业培训并具有葡萄酒品鉴资格证的葡萄酒专业老师和学生进行感官评定。从颜色强度、酸度、收敛性、圆润度、香气浓郁程度、平衡感、总体评分等7个方面对各葡萄酒样品进行品评。

1.4.5 数据处理与分析 采用 Excel 2007进行数据处理，SPSS 19.0对数据进行单因素方差分析，并利用Duncan’s多重比较在置信区间 0.05下对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 酵母多糖对蛇龙珠干红葡萄酒基本理化指标的影响

2.1.1 酵母多糖的添加量对总酸的影响 3种酵母多糖不同添加量对蛇龙珠干红葡萄酒总酸的影响结果见图1。可以看出，添加了3种酵母多糖的处理，其葡萄酒中总酸质量浓度明显降低，随着酵母多糖添加量的增加，总酸质量浓度均呈先下降后趋于稳定的趋势。当多糖添加量为0.15 g/L其总酸质量浓度较之空白对照组差异显著（P＜0.05），酵母甘露聚糖的添加量为0.3 g/L时，总酸质量浓度最低为5.20 g/L，比空白对照组总酸质量浓度降低了13.3%，当多糖添加量大于0.4 g/L时，总酸质量浓度不再降低，其质量浓度基本趋于稳定；当非活性酵母、酵母葡聚糖的添加量均在0.45 g/L时，总酸质量浓度最低为5.25 g/L和5.26 g/L，较之空白对照组分别降低了12.5%和12.3%，且随其添加量的增加总酸质量浓度均趋于稳定。3种多糖相比较，甘露聚糖的降酸效果最佳，这可能与多糖中甘露糖蛋白质量浓度有关，酵母甘露聚糖中甘露糖蛋白的质量浓度均高于其他两种多糖，本试验研究结果表明，酵母多糖能够显著降低干红葡萄酒的酸度，这与荣俊声等[18]在干白葡萄酒中上的研究结果相似。

2.1.2 酵母多糖的添加量对色度的影响 由图2可知，随酵母多糖添加量的增加，蛇龙珠干红葡萄酒色度的变化整体呈先上升后平缓的变化趋势。当添加量为0.15 g/L时，试验组的色度值较之空白对照组差异不显著（P＞0.05）；当非活性酵母，酵母葡聚糖与酵母甘露聚糖的添加量分别在0.45、0.45、0.3 g/L时，色度值达到峰值，其色度较空白对照组差异显著（P＜0.05），并分别提高了 11.5%，13.1%，16.4%，且酵母甘露聚糖添加量为0.3 g/L的色度值均高于其他两种多糖添加量为0.45 g/L的色度值，这一结果表明，当3种酵母多糖的添加量在0.3～0.45 g/L时能够明显提高葡萄酒色度，且酵母甘露聚糖效果最佳。葡萄酒的色度是评价葡萄酒外观质量的一个重要标准，葡萄酒色度的高低主要由葡萄酒中的酚类物质如花色素苷、单宁等决定的，花色素苷、单宁含量越高，葡萄酒的颜色就越深，色度值也就高[19]。

2.1.3 酵母多糖的添加量对色调的影响 由图3可以看出，随着酵母多糖添加量的增加，色调值呈下降的趋势。当酵母甘露聚糖添加量在0.3 g/L时，其色调值最低，为0.61，较空白对照组色调值降低了15.2%；而当非活性酵母与酵母葡聚糖的添加量为0.45 g/L时，其色调值最低，为0.62和0.61，分别降低了13.9%和15.2%，且3个试验组均较空白对照组差异显著（P＜0.05）。 Escot.等[20]人研究表明，甘露糖蛋白与游离色素结合，生成色素化合物阻止了花青素聚集沉淀。而本试验色调的演变结果印证了以上观点，葡萄酒在420 nm时有较低的红光吸收率，而在520 nm时有较高的红光吸收率，两者的比值减小是色调值逐渐下降的主要原因，由此说明加入酵母多糖对葡萄酒保持相对新鲜的红色色泽具有积极作用。

图1 酵母多糖添加量对总酸质量浓度的影响Fig.1 Effect of yeast polysaccharide content on total acid content

图2 酵母多糖添加量对色度的影响Fig.2 Effect of yeast polysaccharide on chroma

2.1.4 酵母多糖的添加量对单宁的影响 单宁是评价葡萄酒品质的重要指标。由图4可知，3种酵母多糖对单宁的影响趋势基本一致，随着酵母多糖添加量的增加，单宁含量呈下降趋势。非活性酵母、酵母葡聚糖与酵母甘露聚糖的添加量分别为0.45、0.45、0.3 g/L时单宁含量最低，分别为1.62、1.64、1.64 g/L，较空白对照组降低了13.4%、12.3%、12.3%，且变化趋势随多糖添加量增加逐渐减缓。可能是由于酵母多糖类物质尤其是甘露糖蛋白与单宁酸等酚类物质相互作用，形成大分子聚合物，从而维持葡萄酒单宁的稳定，提高了酒体的圆润度。有国外学者研究表明，葡萄酒中粗糙单宁含量影响葡萄酒的口感和品质，而多糖可以结合部分单宁以干扰了单宁的粒度来维持酒体中单宁的稳定[21]。

图3 酵母多糖添加量对色调的影响Fig.3 Effect of adding amount of yeast polysaccharide on hue

图4 酵母多糖对单宁质量浓度的影响Fig.4 Effect of yeast polysaccharide on tannin content

2.1.5 酵母多糖对总花色苷的影响 由图5可知，总花色苷质量浓度随酵母多糖添加量的增加呈逐渐上升的趋势，非活性酵母、酵母葡聚糖与酵母甘露聚糖的添加量分别在0.45、0.45、0.3 g/L时，总花色苷质量浓度达到峰值，其中添加酵母甘露聚糖的试验组质量浓度最高，为292.4 mg/L，较空白对照组提升了15.3%。这可能是由于酵母多糖结合葡萄酒中的单体花色素，相互作用形成色素聚合物，从而阻止了部分色素的聚集沉淀[22]。而Asenstorfer[23]研究表明，酵母多糖的某些成分有利于形成新的聚合花色苷，这会使酒体更稳定、耐受pH变化和氧化反应，从而有助于酒体颜色的稳定。随多糖添加量的增加，总花色苷质量浓度有所降低但变化不大，可能是由于形成的多糖色素聚合物聚集而沉淀。

图5 酵母多糖添加量对总花色苷质量浓度的影响Fig. 5 Effect of yeast polysaccharide on total anthocyanins

2.1.6 酵母多糖的添加量对柔和指数的影响 柔和指数反映了葡萄酒的口感、收敛程度和平衡感[24]。由图6可以看出，添加多糖的试验组柔和指数均达到5.0以上，多糖添加量在0.3 g/L时，添加酵母甘露聚糖的试验组的柔和指数达到峰值；而多糖添加量在0.45 g/L时，添加非活性酵母及酵母葡聚糖的试验组柔和指数最高。有研究表明，柔和指数达到5.0以上的葡萄酒品质较好[25]。

图6 酵母多糖添加量对柔和指数的影响Fig.6 Effect of the amount of yeast polysaccharide on the soft index

2.2 酵母多糖对蛇龙珠干红葡萄酒香气物质的影响

根据理化指标的分析结果，分别以3种酵母多糖影响效果最优的试验组进行，非活性酵母与酵母葡聚糖选用添加量为0.45 g/L的试验组，酵母甘露聚糖选用添加量为0.3 g/L的试验组，各试验组其香气成分及质量浓度见表1。

表1 蛇龙珠干红葡萄酒香气成分及质量浓度Table 1 Volatile compounds in wines produced of Cabernet Gernicht wine

续表1

2.2.1 酯类化合物 酯类化合物是对葡萄酒整体香气组成具有积极贡献作用的一类重要物质。由表1可知，添加非活性酵母、酵母葡聚糖及酵母甘露聚糖的试验组与空白对照组相比，试验组检测出的酯类物质分别为18种、17种、19种，而空白对照组只检测到13种，其质量浓度分别为 6.03、5.4、6.45、5.15 mg/L。试验组检测出新的风味物质有乙酸己酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、辛酸戊酯、辛酸-3-甲基丁酯、10-十一烯酸乙酯、棕榈酸乙酯等6种酯类物质。由此可见，添加酵母多糖可增加酯类物质的种类与质量浓度，其中添加酵母甘露聚糖的试验组酯类物质种类与质量浓度最高，较对照组提高了46.15%和25.24%。Lubber等[26]研究证明，作为酵母多糖主要成分的甘露糖蛋白，其蛋白端可通过与酒体中香气物质作用来增加香气的稳定性并提高香气持久性。

此外，添加酵母多糖的葡萄酒中具有花香、果香的乙酯化合物质量浓度明显增多。例如乳酸乙酯具有果香、朗姆酒味、牛奶香味，添加酵母甘露聚糖的试验组质量浓度最高达到0.50 mg/L；而具有梨香、白兰地香的癸酸乙酯，试验组质量浓度均达到1mg/L以上。这些香气物质能赋予葡萄酒独特的香气，增加其香气馥郁性、协调感，提高葡萄酒品质。

2.2.2 醇类物质 醇类化合物是葡萄酒样中检测到的又一大化合物，主要由发酵过程中糖代谢产生。由表1可知，试验组与对照组比，醇类物质的种类与质量浓度均相差不大。3个多糖试验组均检测出10种醇类物质，空白对照组检测出8种，其质量浓度分别为 6.00、6.40、6.13、6.07 mg/L。 可能是由于醇类物质大部分来源于酒精发酵阶段，而酵母多糖添加于陈酿前，使得试验组与对照组的醇类物质相差不大。

2.2.3 酸类物质 酸类化合物是葡萄酒发酵过程中代谢副产物，当质量浓度过高时会对葡萄酒的感官质量造成负面影响。由表1可知，试验组与空白对照组分别检测出9种、9种、8种与9种，总质量浓度分别为 1.51、1.52、1.49、1.61 mg/L，其中添加甘露聚糖的试验组质量浓度最低，较空白对照组降低了7.5%。酸类化合物种类差别不大，质量浓度明显降低，可能是由于多糖物质与挥发性酸类化合物相互作用降低了挥发性酸类物质质量浓度。

2.2.4 醛酮及萜稀类化合物 添加非活性酵母，酵母葡聚糖及酵母甘露聚糖的试验组检测到的醛酮及萜稀类物质分别为7种、7种、8种，而对照组检测到4种。试验组检测出的风味物质有大马士酮、癸醛、松油醇、香茅醇、6-叔丁基间甲酚，其中添加酵母甘露聚糖的试验组醛酮及萜稀类化合物种类与质量浓度到达最高，较空白对照组均提升了50%。虽然这些物质在葡萄酒中质量浓度较低，但对总体的风味构成起到了积极作用，如萜稀类物质可以赋予酒体花香，果香和植物香，对提高酒体的整体风味具有一定贡献[27-28]。

2.3 感官分析

由图7可以看出，试验组和对照组清澈度和酸度差异不明显，其他项目均有较大的差异。从颜色强度来分析，试验组的颜色强度值均高于对照组，可能是由于多糖与酚类物质结合，阻止了与单宁相互作用，维持红葡萄酒的颜色稳定。而从口感收敛性与圆润程度来分析，对照组的收敛性较强而圆润度较低，这可能与单宁质量浓度有关。酵母多糖结合葡萄酒中的单宁，掩盖了某些单宁的粗糙感和生青味，降低了收敛感，增加了葡萄酒的圆润程度。从香气浓郁度与整体评分分析，空白对照组的香气浓郁度与整体评分最低，添加酵母甘露聚糖的试验组香气浓郁度与整体评分最高，具有浓烈的果香与花香，受欢迎程度较高。

图7 感官分析雷达图Fig.7 Radar map of sensory analysis

3 结语

通过添加3种不同酵母多糖，分析其对蛇龙珠干红葡萄酒品质的影响。结果表明，3种多糖均对葡萄酒品质具有积极作用。其中，非活性酵母、酵母葡聚糖及酵母甘露聚糖的添加量分别为0.45，0.45，0.3 mg/L时影响效果最显著，且酵母甘露聚糖作用效果最佳，可降低葡萄酒的酸度，稳定葡萄酒颜色，使其更加亮丽。酵母多糖结合酒中的粗糙单宁，减少单宁质量浓度，平衡葡萄酒构架使其口感更加柔和，圆润。同时，添加酵母多糖可增加葡萄酒香气的复杂性，稳定香气成分，提高香气的持久性。