术后切口疼痛对大鼠舒芬太尼药物依赖性形成的影响

马小芳 李玉兰 童 茜 王晶晶 贾 强 王 瑞

(兰州大学第一医院麻醉科，兰州730000)

药物依赖（又称药物依赖），是以失去控制地应用成瘾性药物为特征的一种慢性、复发性神经精神障碍性疾病，表现为以戒断症状为特征的躯体依赖和以渴求依赖药物为特征的精神依赖。目前，阿片类药物是临床上治疗中、重度疼痛最有效的药物，具有依赖性及非医疗目的用药风险，有研究报道，健康个体长期使用阿片类药物可产生依赖性[1]。但治疗慢性疼痛时阿片类药物依赖很罕见[2,3]，具体机制不明确；有研究表明[4～6]，吗啡和芬太尼治疗神经病理性疼痛时会增加吗啡和芬太尼诱导的条件性位置偏爱和自身给药行为，从而增强其精神依赖性的形成。但也有研究表明[7]，甲醛炎性疼痛会减弱吗啡的奖赏效应，从而减弱精神依赖性的形成。

舒芬太尼 (sufentanil) 是一种强效阿片类镇痛药，也是一种特异性µ受体激动剂，其镇痛作用强于芬太尼和吗啡，具有起效快、镇痛强、持续时间长和安全范围广等特点，已被广泛用于临床术后镇痛，像多数阿片类药物一样具有急性耐受和依赖性[8,9]。但舒芬太尼在治疗术后切口疼痛过程中是否会产生依赖性、或者药物依赖性有何变化，目前国内外尚无文献报道。本实验通过建立大鼠术后切口疼痛模型，探讨术后切口疼痛对舒芬太尼躯体依赖性和精神依赖性的影响，为临床上安全使用舒芬太尼术后镇痛提供依据。

方 法

1.实验动物

SPF级成年雄性SD大鼠，体质量(185±17) g，购自兰州大学基础医学院[动物许可证号SCXK（甘）2013-0002]，所有大鼠饲养环境温度控制在(20 ± 2)℃，湿度50%～70%，分笼饲养，每笼5只，控制12 h /12 h昼夜节律，自由摄食饮水。动物饲养及动物实验方案遵循国家《实验动物管理条例》。

2.主要试剂和仪器

枸橼酸舒芬太尼注射液（批号：1160907，宜昌人福药业集团有限公司）；注射用盐酸纳洛酮 （批号：12150701，山西普德药业股份有限公司）；大鼠多巴胺 (DA) 酶联免疫吸附实验 (ELISA) 试剂盒（美国R&D公司）；七氟醚（SVEOFRANE®，批号：16122932，上海恒瑞医药有限公司）；PBS磷酸盐缓冲液（西安HEART公司）。大鼠条件性位置偏爱箱 (Conditional position preference box, CPP)：根据大鼠避暗穿梭箱（YLS-17B，济南益延科技发展有限公司）及文献[10]制作，长宽高分别为60 cm×30 cm×30 cm，箱体中间有30 cm高的抽动隔板，将实验箱分成2个相同体积的黑白方箱，黑箱底部光滑，白箱底部粗糙。大鼠手术器械（上海医疗器械厂）；H1650离心机（长沙湘仪）；RT-6500酶标仪 (Rayto)；超低温冰箱、碎花制冰机（Panasonic公司）；20 ml玻璃匀浆器（上海博通）。

3.方法

术后疼痛对舒芬太尼躯体依赖性的影响

（1）动物分组：24只SD雄性大鼠，按随机数字表法分为四组：假手术组（C组）、疼痛模型组（P组）、假手术+舒芬太尼组（CS组）、疼痛模型+舒芬太尼组（PS组），每组6只。

（2）术后切口疼痛模型制备：P组和PS组大鼠吸入七氟醚麻醉至翻正反射消失，按照Brennan[11]法制备大鼠趾部术后疼痛模型，形成长达1.0 cm的纵行切口，伤口处涂抹红霉素软膏预防感染。C组和CS组只做七氟醚麻醉不做手术处理。

（3）累积疼痛评分：疼痛模型建立1小时后，所有大鼠分别放入玻璃箱 (40 cm×40 cm×40 cm)中采用“累积疼痛评分法”[11]观察其术侧后爪着地和负重情况，术侧后爪着地被压迫至发白为负重。术侧后爪因疼痛而翘起不着地为2分；着地但不负重（即后爪不发白）为1分；着地并负重为0分；非术侧同术侧评分。每5 min观察1次，每次观察1 min，以1 min内大鼠最常采用的站姿作为标准，共观察1 h（0～24分）。累积疼痛评分=术侧足评分-对侧足评分。

（4）给药方法及观察指标：24只大鼠累积疼痛评分结束后，按照递增剂量法连续7天腹腔注射(ip.)舒芬太尼建立躯体依赖模型，CS组和PS组每天8:00与 14:00腹腔注射 舒芬太尼 5 μg·kg-1，每天增加5 μg·kg-1，到第 6 天和第 7 天剂量达到 30 μg·kg-1[12]，C组和P组同时间点注射等体积生理盐水。第7天注药后30 min所有大鼠 (ip.)纳洛酮5 mg·kg-1[13]，诱发戒断症状，放入玻璃箱中进行戒断评分20 min。戒断评分的可数症状包括：齿颤、咀嚼、直立、湿狗样抖、跳跃，直接记录次数得分；不可数症状包括上睑下垂、流泪、流涎、眨眼、腹泻，每2 min评定1次，有则为1分，没有则0分，每项最高10分；全部体征得分之和为戒断总评分；戒断前后30 min称大鼠体重，并计算体重下降值[14]。

4.术后疼痛对舒芬太尼精神依赖性的影响

（1）动物分组：另24只大鼠，按随机数字表法分为四组：假手术组（C组）、疼痛模型组（P组）、假手术+舒芬太尼组（CS组）、疼痛模型+舒芬太尼组 (PS组)，每组6只。

（2）趾部术后疼痛模型制备：P组和PS组大鼠根据Brennan[11]法制备大鼠趾部术后疼痛模型。

（3）累积疼痛评分：疼痛模型建立1小时后，24只大鼠分别放入玻璃箱中采用“累积疼痛评分法”[10]观察疼痛行为。

（4）给药方法及观察指标：24只大鼠累积疼痛评分结束后，按照恒定剂量法连续7天交替 (ip.)舒芬太尼和生理盐水建立精神依赖模型。第1天大鼠在CCP箱中自由穿梭适应环境30 min。第2天在CPP箱中观察24只大鼠在白箱和黑箱的停留时间（共15 min），确定大鼠的天然偏爱倾向，大鼠对黑箱表现天然偏爱，故选择白箱为伴药箱。第3～9天，CS组和PS组大鼠每天8:00 (ip.) 舒芬太尼 20 μg·kg-1后放入白箱自由活动30 min，14:00 (ip.)同等体积生理盐水后放入非伴药箱（黑箱）自由活动30 min，同一时间同种方法连续训练7天；C组和P组除 (ip.)同等体积的生理盐水外，其余处理同实验组。第10天进行CPP测试：将所有大鼠放入中间箱，秒表记录15 min内黑白箱的时间并计算差值，CPP值=伴药箱-非伴药箱时间[15]。

（5）组织采集及匀浆液的制备：24只大鼠检测CPP值后，在冰台上断头取大鼠脑组织，用预冷PBS液反复冲洗并称重，放入-85℃冰箱保存备用。待完成所有标本采集后，在冰浴中向20 ml玻璃匀浆器中加入一定量的预冷PBS液，将标本研磨制成组织匀浆，4℃、1 200 r/min离心20 min后，取上清液按大鼠多巴胺 (DA) ELISA盒说明操作，测脑组织DA含量。

5.统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料结果以均数±标准差()表示，组间比较用单因素方差分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.术后切口疼痛对舒芬太尼躯体依赖性形成的影响

①大鼠存活情况：在进行七氟醚麻醉、疼痛模型建立、舒芬太尼递增剂量法给药以及纳洛酮诱导戒断症状过程中大鼠均无死亡。②累积疼痛评分：P组和PS组显著高于C组和CS组（P＜ 0.01，见表1）。③戒断评分：分别与C组和P组相比，CS组和PS组戒断评分增高(P＜ 0.01)；其余各组间戒断评分无统计学意义（见表1）。④体重下降值：分别与C组和P组相比，CS组和PS组体重下降值增高(P＜ 0.05)，其余各组间体重下降值无统计学意义（见表1）。

2.术后切口疼痛对舒芬太尼精神依赖形成的影响

①大鼠存活情况：在进行七氟醚麻醉、疼痛模型建立、舒芬太尼恒定剂量法给药以及CPP实验过程中大鼠均无死亡。②累积疼痛评分：P组和PS组累积疼痛评分较C组和CS组显著增高(P＜ 0.01)，差异有统计学意义（见表2）。③CPP值：分别与C组和P组相比，CS组和PS组CPP值增高(P＜ 0.01)；与CS组相比，PS组CPP值降低（P＜ 0.01）；其余各组间相比CPP值无统计学意义（见表2）。④DA含量：分别与C组和P组相比，CS组和PS组的脑组织DA含量均增高(P＜ 0.01,P＜ 0.05)；与CS组相比，PS组脑组织DA含量降低(P＜ 0.01)；其余各组间脑组织DA含量无统计学意义（见表2）。

讨 论

术后切口疼痛属于炎症性痛，是一种释放炎性因子引起的急性疼痛，是由手术导致外周组织损伤引起炎症反应导致的[16]，术后疼痛一般不超过7天，但术后急性疼痛治疗不当可能发展为慢性疼痛，本实验选择Brennan[11]法制备大鼠趾部术后切口疼痛模型，此模型较其他疼痛模型（如甲醛炎性痛模型、神经病理性疼痛模型）更加符合病人术后疼痛的病理学特点。本实验采用累积疼痛评分来观察大鼠的疼痛反应，结果显示疼痛干预组大鼠（P组和PS组）在术后1 h 累积疼痛评分升高，说明该伤害性刺激确切有效，术后疼痛模型建立成功。

舒芬太尼是目前国内使用最多的术后静脉镇痛药，根据本实验预实验结果和参考文献[12]，大鼠(ip.) 舒芬太尼超过30 μg·kg-1时，大鼠翻正反射消失且有呼吸抑制，甚至导致大鼠死亡。故选择递增剂量法连续 7天 (ip.) 舒芬太尼（5～ 30 μg·kg-1每日2次），观察纳洛酮诱导戒断症状及体重变化；按照恒定剂量法连续7天交替(ip.) 舒芬太尼(20 μg·kg-1，每天 1次） 或生理盐水进行实验。

阿片类药物躯体依赖性是大量重复使用外源性阿片类药物导致内源性阿片肽的形成和释放减少，同时对外源性阿片药物产生耐受的病理现象，一旦停药，内源性阿片肽不能满足机体需要，使机体发生紊乱并产生戒断症状。纳洛酮催促的戒断症状是评估药物躯体依赖的主要方法[17]，通过观察戒断症状和体重下降值，来评估舒芬太尼躯体依赖的形成及术后疼痛对躯体依赖性的影响。实验结果发现，使用舒芬太尼的大鼠（CS组和PS组）均会出现戒断症状和体重下降，从而形成躯体依赖性，但术后切口疼痛对躯体依赖的形成无明显影响。

正常情况下，大脑腹侧被盖区 (VTA) µ 阿片受体的激活抑制GABA能神经元，减少GABA的释放，取消对中脑边缘DA能神经元的紧张性抑制，使释放到伏隔核区 (NAc) 的DA含量增加，作用于多巴胺受体，导致µ阿片受体激动剂诱导的奖赏效应，从而产生精神依赖性[7]。长期反复使用µ阿片受体激动剂，中脑边缘DA能系统内相关核团和神经元发生适应性改变，使DA含量、DA受体等发生变化，从而形成精神依赖的神经生物学基础。条件性位置偏爱实验(CPP)是评估药物精神依赖性最常用的方法[17]。实验结果显示，使用舒芬太尼的大鼠（CS组和PS组）CPP值和脑组织DA含量均升高，提示大鼠长期使用舒芬太尼可以产生精神依赖性；应用舒芬太尼的术后切口疼痛大鼠（PS组）与应用舒芬太尼的假手术大鼠（CS组）相比较，脑组织DA含量和CPP值均较低，提示术后切口疼痛存在可减弱大鼠精神依赖性的形成。此结果对临床术后镇痛使用舒芬太尼有一定指导意义。与阿片类药物依赖相关的DA释放主要在脑组织NAc区，但是大鼠脑组织中NAc质量极微，取标本不易成功。因此舒芬太尼对大鼠大脑NAc区的DA含量的影响还需进一步研究，是本实验的不足之处。

表1 术后切口疼痛对戒断评分及体重下降值的影响 (n = 6,D)Table1 Effect of postoperative incision pain on withdrawal score and weight loss (n = 6,D)

表1 术后切口疼痛对戒断评分及体重下降值的影响 (n = 6,D)Table1 Effect of postoperative incision pain on withdrawal score and weight loss (n = 6,D)

*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01，与 C 组相比；△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，与P组相比；##P ＜ 0.01，与 CS 组相比*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group C; △P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01, compared with group P; ##P ＜ 0.01, compared with group CS.

体重下降值(g)Weight loss C 1.00±0.63 8.67±2.16 1.08±0.94 P 21.83±0.75** 7.50±4.04 1.16±1.03 CS 1.16±0.75△△ 92.67±29.35**△△ 4.05±2.21*△PS 22.00±0.89**## 75.50±25.07**△△ 4.13±2.03*△组别Group累积疼痛评分(分)Cumulative pain score戒断症状评分(分)Withdrawal score

表2 术后切口疼痛对CPP值及脑组织DA含量的影响 (n = 6,D)Table2 Effect of postoperative incision pain on CPP value and DA content in brain tissue (n = 6,D)

表2 术后切口疼痛对CPP值及脑组织DA含量的影响 (n = 6,D)Table2 Effect of postoperative incision pain on CPP value and DA content in brain tissue (n = 6,D)

*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01，与 C 组相比；△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，与P组相比；##P ＜ 0.01，与 CS 组相比*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group C; △P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01, compared with group P; ##P ＜ 0.01, compared with group CS.

DA含量(µg/g)DA content (µg/g)C 1.17±0.75 -17.00±8.17 2185.73±88.71 P 22.33±1.37** -18.33±4.63 2141.33±101.64 CS 1.16±0.41△△ 141.67±38.48**△△ 3395.02±278.10**△△PS 21.83±1.17**## 66.00±29.64**△△## 2473.83±267.79*△##组别Group累积疼痛评分(分)Cumulative pain score CPP值(s)CPP value (s)

Narita, Ozaki, Martin等[7,18,19]研究发现，疼痛可以减弱吗啡引起的条件性位置偏爱，从而减弱精神依赖性的形成；Suzuki等人[10]研究发现，在NAc区中脑边缘多巴胺能神经元突触的突触前膜上分布有κ阿片受体，当炎性疼痛激活κ受体后可引起突触前抑制，从而降低NAc区DA的释放，导致µ受体激动剂引起的精神依赖性减弱，这可能也是术后切口疼痛减弱舒芬太尼精神依赖性的机制，具体还需进一步研究。这些实验结论与本实验一致。

也有一些研究结论与本实验不同。Cahill,Zhang, Woller等人发现[4～6]，吗啡和芬太尼治疗神经病理性疼痛、吗啡治疗弗氏完全佐剂所致的持续性疼痛时，会增加吗啡和芬太尼诱导的条件性位置偏爱和自身给药行为，从而增强其精神依赖性的形成。认为这很可能与疼痛模型的不同有关，因此对阿片类药物的反应和依赖性也不同[6]。

综上所述，长期反复使用舒芬太尼的大鼠可以产生躯体依赖性和精神依赖性；术后切口疼痛可以减弱舒芬太尼精神依赖的形成，但对躯体依赖性的形成无明显影响。提示临床使用舒芬太尼术后长期镇痛时，需密切监测药物躯体依赖性的形成，并防范舒芬太尼精神依赖性的形成。有关人体使用舒芬太尼产生依赖性的时间限制问题，还需进一步研究。