基于脊髓 NLRP1-Caspase-1-IL-1β通路探讨电针治疗神经病理性疼痛的作用机制*

王志福 杨意州 刘建波 李长征 龚德贵 俞向梅△

(1福建中医药大学中西医结合学院，福州350122；2福建中医药大学附属康复医院，福州350003)

神经病理性疼痛常见于各种疾患中，治疗迁延反复。各种药物的治疗，仍存在一定的不良反应，电针治疗神经病理性疼痛具有安全、简便而无副作用的优点，临床及基础研究已证实电针镇痛的有效性，而其机制仍需进一步深入研究[1,2]。白介素-1β(Interleukin-1 beta, IL-1β) 作为重要的促炎细胞因子之一，在神经性病理性疼痛的产生和维持中起重要作用[3]。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 (nod-like receptor proteins, NLRP) 炎性体，是一类由NLRP蛋白家族成员、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1 (cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1)和 接 头 蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing caspase-activating recruitment domain, ASC) 组成的蛋白复合物，已知其主要功能是参与IL-1β的成熟过程[4,5]。NLRP1是人类NLRP家族中最早发现的一个成员，基础及临床研究发现，NLRP1可识别和感知体内外各种伤害性信号，与各种疼痛（如复杂性区域疼痛综合征、佐剂关节炎、慢性盆腔疼痛综合征等）发生密切相关，表现为外周组织及脊髓内NLRP1、caspase-1、IL-1β等活化增加。炎症小体中，NLRP1及其产物caspase-1是IL-1β成熟的重要上游通路，激活的NLRP1参与疼痛敏化的形成过程[6～9]。外周神经损伤时，脊髓IL-1β 转录表达大量IL-1β前体分子，被重要蛋白酶caspase-1剪切为成熟IL-1β，从而发挥生物学活性[10]。

本项目组前期实验研究证实，在神经病理性疼痛发生时，脊髓内大量IL-1β成熟释放，与NLRP1及caspase-1活化密切相关；电针环跳、阳陵泉对神经病理性疼痛具有明显的抗炎镇痛作用，可减少脊髓内IL-1β的产生[6,11,12]。而电针是否可通过调节脊髓NLRP1及caspase-1活性，从而降低脊髓IL-1β释放，以发挥抗炎镇痛作用，是本研究关注的主要问题。

方 法

1.实验动物

SPF 级雄性 Sprague-Dawley大鼠42只，体重200～220 g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，生产许可证号 SCXK（沪）2012-0002。在福建中医药大学实验动物中心分笼适应性喂养1周，许可证号SYXK（闽）2013-009。将大鼠称重并编号。所有实验均遵照国际动物保护和使用指南的规定实施。

2.试剂与仪器

使用4-0铬制羊肠线（上海浦东金环医疗用品股份有限公司）。华佗牌一次性针灸针 (0.28 mm×15 mm)、电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）。Belnacasan,VX-765 （货号：S2228，50 mg粉末装），美国Selleck生物科技有限公司；胞壁酰二肽(Muramyl Dipeptide，MDP，货号：A9519，规格：5 mg)， 美 国 Sigma公 司。NLRP1、Caspase-1，GAPDH引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。IQ5多重实时荧光定量 PCR仪器，美国Bio-Rad公司。38450 -电子触觉测量仪（电子Von Frey），意大利Ugo Basile公司；辐射热测痛仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司）。

3.实验分组及模型制备

采用随机数字表法将大鼠分为模型组(CCI)、假手术组(Sham-operation)、电针组(Electro-acupuncture, EA)、非电针组 (Sham-EA)、DMSO组、VX-765(Caspase1抑制剂)组、MDP （NLRP1激活剂）组，每组各6只。模型组建立坐骨神经慢性限制性损伤 (chronic constriction injury, CCI) 神经病理性疼痛模型，不干预；假手术组只切开皮肤，不结扎坐骨神经；电针组造模成功第7天后(P7)，选取“环跳”、“阳陵泉”穴电针，每日1次，持续干预至P14；非电针组大鼠只进行针刺如上穴位，不接通电针治疗仪；DMSO组造模成功第7天后(P7)，脊髓鞘内注射8% DMSO 3次，每次注射20 µl；VX-765（Caspase-1抑制剂）组分别在P7、P10、P14脊髓鞘内注射VX-765（溶解于8% DMSO，2 mg/kg注射）各1次；MDP组分别在P7、P10、P14脊髓鞘内注射MDP（溶解于8%DMSO，0.1 mg/kg注射）各1次。坐骨神经慢性限制性损伤 (chronic constriction injury,CCI)神经病理性疼痛模型制备过程如下：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉 (4 ml/kg) 后，右侧后肢皮肤切开，肌肉钝性分离，暴露坐骨神经，在坐骨神经中段用4-0铬制羊肠线松扎四道，致慢性CCI神经病理性疼痛大鼠模型，术后在伤口处撒适量青霉素粉末预防感染。模型建立后，术后第7日 (P7)和第14日 (P14) 观察实验大鼠机械痛、热痛行为学变化。

4.电针干预方法

电针穴位参照大鼠穴位图谱（华兴邦, 周浩良.大鼠穴位图谱的研制.实验动物与动物实验,1991），结合本课题以往研究经验[12]，拟取手术患侧 (右侧) 肢体的“环跳”(GB30) 与“阳陵泉”(GB34)穴，给予“疏密波”（2 Hz/100 Hz 交替；强度≤1 mA；时间 30 min）电针治疗。安静环境中，室温20±2℃，将大鼠躯干固定于木架上，头部与四肢可自由活动，静置 20 min后，将 0.25寸一次性针灸针刺入大鼠右侧“环跳”与“阳陵泉”穴，通过G6805-1A型多功能电针治疗仪给予“疏密波”刺激，强度以引起大鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜 (≤ 1 mA)。

5.脊髓鞘内注射方法

大鼠取俯卧位，实验者食指定位于大鼠脊柱L5-6间隙，右手持微量注射器从间隙垂直缓慢进针，以大鼠尾巴出现颤动或突然的侧向甩动作为穿刺成功的标志，注入相应的工具药 (VX-765、MDP) 或等剂量 DMSO 缓冲液 20 µl。

6.观测指标

（1）机械痛行为测试

测试环境为10 cm × 20 cm × 20 cm有机玻璃笼，将大鼠放入笼内静置10 min后，采用Ugo Basile原创设计的电子触觉测量仪(e-VF)，自动记录大鼠的受刺激强度（即大鼠的缩爪反应阈值），以此反应大鼠的机械痛敏情况。

（2）热痛行为测试

安静环境中，室温 20±2℃，将大鼠放入测痛仪上方的玻璃格子中，自由活动。大鼠静置20 min后，采用336型辐射热测痛仪强光照射大鼠足掌，测定大鼠的缩爪潜伏期 (paw withdrawal latency, PWL)。测定时每次间隔不低于l min，大鼠 PWL 基本稳定后取后3次测定结果的平均值作为基础值 (baseline)。测定时热源强度维持在恒定水平，使基础痛阈控制在8～12 s左右。为防止大鼠热辐射烫伤，将PWL的上限值 (cut-off time) 定为20 s。

（3）脊髓IL-1β、NLRP1、Caspase-1检测

全部实验结束后 (P14)，迅速新鲜取材脊髓 （L4-5节段）背角置于液氮中，最后储存于-80℃保存待测。ELISA法检测脊髓成熟蛋白IL-1β表达变化，real time-PCR检测脊髓NLRP1、caspase-1 mRNA表达变化。

7.统计学分析

采用 SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析，所有数据均用均数±标准误 ()表示。实验数据符合正态分布，采用单因素方差分析；不符合正态分布，采用秩和检验中独立样本比较。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.神经病理性疼痛大鼠机械痛、热痛行为学变化

与假手术组相比，模型组 (CCI) 大鼠从造模后第7天、第14天，机械痛、热痛阈值均显著降低 (P＜ 0.01)；与模型组相比，多次电针可显著提高CCI大鼠机械痛、热痛阈值 (P＜ 0.01)，非电针并未改变痛行为学变化（见图1A, 1B）。

与模型组相比，多次脊髓鞘内注射VX-765则可明显提高大鼠机械痛、热痛阈值(P＜ 0.01)，而多次脊髓鞘内注射MDP却可进一步降低大鼠机械痛、热痛阈值 (P＜ 0.01、P＜ 0.05，见图 2A, 2B)。

2.神经病理性疼痛大鼠脊髓NLRP1、Caspase-1mRNA表达变化的影响

在造模后第14天，与假手术组相比，模型组大鼠脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA表达显著增加(P＜ 0.01)；与模型组相比，多次电针可显著降低脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA的表达 (P＜ 0.01)，鞘内注射caspase-1抑制剂 (VX-765)可显著抑制脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA的表达 (P＜ 0.01)；相反，鞘内注射NLRP1激活剂 (MDP)则进一步上调脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA的表达 (P＜ 0.01，见图 3A, 3B)。

3.神经病理性疼痛大鼠脊髓IL-1β表达变化的影响

在造模后第14天，脊髓ELISA检测方法结果提示，与假手术组相比，模型组大鼠脊髓背角成熟蛋白IL-1β的表达显著增加 (P＜ 0.01)；与模型组相比，多次电针可显著降低脊髓背角IL-1β蛋白的表达 (P＜ 0.01)，脊髓鞘内注射caspase-1抑制剂 (VX-765)可显著抑制脊髓成熟蛋白IL-1β的表达 (P＜0.01)；相反，鞘内注射NLRP1激活剂 (MDP) 则进一步上调脊髓IL-1β的表达 (P＜ 0.01，见图4)。

讨 论

神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统的损害或疾病导致的疼痛；神经病理性疼痛发生时，脊髓中枢内出现显著的神经炎症，抑制脊髓中枢炎症可减轻痛敏反应[13,14]。经典CCI神经病理性疼痛大鼠模型，在一定程度上模拟临床干性坐骨神经病理性疼痛特点。本课题组前期研究证实，电针“环跳”、“阳陵泉”穴对神经病理性疼痛大鼠具有显著镇痛作用[12,15]，临床应用二穴电针治疗坐骨神经病理性疼痛，疗效明确，其脊髓中枢机制有待进一步明确[16,17]。

图1 电针对神经痛大鼠机械痛、热痛行为变化的影响(n = 6,EM)Fig.1 Changes of the paw withdrawal threshold and paw withdrawal latency with Electroacupuncture intervention (n = 6,EM)

图2 NLRP1Caspase-1对神经痛大鼠机械痛、热痛行为变化的影响(n = 6,EM)Fig.2 Changes of the paw withdrawal threshold and paw withdrawal latency with NLRP1Caspase-1 pathway regulation (n = 6,EM)

图3 电针对神经痛大鼠脊髓NLRP1、Caspase-1mRNA表达变化的影响(n = 4,EM)Fig.3 Changes of the spinal expression of NLRP1 and Caspase-1 mRNA with Electroacupuncture intervention(n = 4,EM)

图4 电针对神经痛大鼠脊髓IL-1β表达变化的影响(n = 4,EM)Fig.4 Changes of the spinal expression of IL-1β protein with Electroacupuncture intervention (n = 4,EM)

坐骨神经病理性疼痛属中医学痹症的范畴，现代医学分析，环跳、阳陵泉穴深层解剖 为坐骨神经及其分支；针刺刺激穴位邻近神经及其周围血管，可促进局部血液循环，改善局部炎症和渗出，缓解神经病理性疼痛症状[18]。

本课题组前期研究表明，在神经病理性疼痛的发生及发展中，脊髓胶质细胞活化可释放促炎症因子(IL-1β、IL-6等)，维持脊髓中枢敏化和神经炎症反应。在神经病理性疼痛大鼠脊髓中，NLRP-l炎症小体被显著激活，激活的NLRP-l及caspase-1主要表达于脊髓背角浅层星形胶质细胞中[6,11,19]。当受到外来刺激时，激活的炎症小体NLRP-l可水解其组成结构中的pro-caspase-1分子使其成为成熟caspase-1，成熟caspase-1大量释放并剪切IL-1β前体分子变成为成熟IL-1β，参与炎症反应过程[20]。结合既往文献报道及前期研究，本实验说明，神经病理性疼痛发生发展过程中，脊髓内炎症小体NLRP-l和caspase-1激活，促进脊髓IL-1β成熟释放，维持中枢敏化和神经炎症，表现机械痛和热痛过敏反应。应用电针或caspase-1抑制剂可降低脊髓IL-1β表达水平，提高神经病理性疼痛大鼠痛阈值，从而发挥抗炎镇痛作用；然而，经典NLRP-l激活物（胞壁酰二肽，MDP）鞘内注射可显著激活NLRP-l-caspase-1-IL-1β信号通路，促进脊髓IL-1β释放增多，进一步诱发痛敏反应。

综上所述，神经病理性疼痛发生发展与脊髓背角NLRP-l-caspase-1-IL-1β信号通路活化存在密切的联系，电针抗炎镇痛作用机制可能与抑制脊髓NLRP-l-caspase-1-IL-1β通路活化有关，今后可应用NLRP-l、IL-1β、Caspase-1等基因敲除小鼠深入开展实验，进一步明确电针抗炎镇痛的脊髓中枢IL-β调节机制。