龙眼肉不同提取物的神经保护作用及其机制

倪雪娇 陈晓霞 宋婷 贾思禹 李红艳

【摘 要】 目的：探讨龙眼肉的神经保护作用及其机制。方法：采用Aβ诱导PC12细胞损伤，用龙眼肉不同提取物作用于损伤的PC12细胞，Elisa试剂盒检测SOD、MDA水平，MTT检测细胞增殖；采用H2O2诱导PC12细胞损伤，Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡。结果：龙眼肉水提取物和正丁醇提取物能提高Aβ诱导损伤的细胞存活和SOD活力，抑制H2O2诱导损伤的早期细胞凋亡，对MDA含量无明显影响；乙酸乙酯提取物可减少H2O2诱导损伤的各期细胞凋亡及坏死，但对Aβ诱导损伤的细胞存活以及SOD活力和MDA含量无明显影响。结论：龙眼肉具有神经细胞保护作用，但不同提取物作用机制可能不同。

【关键词】 龙眼肉；神经保护；抗氧化；凋亡

【中图分类号】R285 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）11-0019-03

Abstract：Objective To explore the neuroprotective effect and mechanism of longan meat. Methods Using Aβ to induce PC12 cell injury， with different extracts of longan meat on the injured PC12 cells， Elisa kit to detect SOD、 MDA levels， MTT assay for cell proliferation； H2O2 induced PC12 cell injury， detection of Apoptosis by Annexin V-FITC / PI Double Staining. Results Longan meat extract and n-butanol extract can improve the cell viability and SOD activity， inhibition of early apoptosis， and no significant effect on MDA content induced by Aβ； Ethyl acetate extract can reduce cell apoptosis and necrosis induced by H2O2， but no significant effect on cell viability， SOD activity and MDA content induced by Aβ. Conclusion Longan meat extract has a neuroprotective effect， but the mechanisms of different extraction may be different.

Keywords：Longan Meat； Neuroprotective； Anti-Oxidation； Apoptosis

龙眼肉为无患子科植物龙眼Dimocarpus longan Lour. 的假种皮，属药食同源类中药，具有补益心脾，养血安神之功效；临床用于气血不足，健忘失眠等症[1]。现代研究表明，龙眼肉具有改善记忆[2]、抗焦虑[3]、抗氧化[4-5]等多种作用，据报道，氧化应激很可能是记忆减退、焦虑证等的一个共同诱因[6-7]。PC12 细胞来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，因其具有许多神经元特性，被广泛用于老年痴呆、焦虑证等神经系统疾病的体外研究[8]。基于龙眼肉的上述作用，作者推测，龙眼肉很可能具有神经细胞保护作用；课题组前期研究也表明，龙眼肉提取物能够促进PC12细胞增殖并抑制其凋亡[9]，但对不同提取物的神经保护作用及其机制的比较研究前期未做报道。本研究通过比较龙眼肉不同提取物对细胞增殖、凋亡及氧化应激的影响，探讨龙眼肉不同提取物的神经保护作用，为系统研究龙眼肉神经保护作用的物质基础及机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 龙眼肉，安徽益生源中药饮片科技有限公司（批号160301）；高分化PC12细胞，辽宁中医药大学药理实验室提供；DMEM高糖培养基（批号8116244），Gibco；胰蛋白酶（批号GP3108）、青链霉素双抗溶液（批号GA3502）、Annexin V-FITC/PI双染试剂盒（批号113688），Genview；胎牛血清（批号：20160629），四季青；MTT（批号M8180），北京Solaibio；Aβ25-35（批號095M4774V），Sigma；SOD（批号DZE30169）、MDA（批号DZE30157） Elisa试剂盒，南京建成；NU-4750型二氧化碳培养箱，Nuaire；RE-52 旋转蒸发仪，上海亚荣；NIB-100F型倒置荧光显微镜，宁波永新；MR-96A型酶标仪，深圳迈瑞；NoVocyte 451141112066流式细胞仪，艾森生物。

1.2 方法

1.2.1 龙眼肉不同提取物的制备 龙眼肉，用1∶12（m∶v）的去离子水微沸提取1 h，提取3次，合并滤液，按极性大小，依次采用乙酸乙酯和正丁醇萃取，收集合并各次滤液，分别得到龙眼肉的乙酸乙酯、正丁醇和水提取物，60 ℃减压浓缩，4 ℃密封保存。

1.2.2 MTT实验及SOD、MDA水平测定 对数生长期的PC12细胞以105/mL密度，接种于96孔板，37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h后，随机分为正常组、模型组和龙眼肉提取物高低剂量组及石杉碱甲组，于加入Aβ前2 h加入；模型组与给药组同步加入Aβ25μM；正常组常规培养。加入Aβ24 h后，吸出各组细胞上清液，采用Elisa试剂盒检测SOD活性及MDA含量；细胞中加入5 mg/mL MTT，继续培养4～6 h，加入100μL DMSO于酶标仪490 nm处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 PC12细胞接种于6 cm培养皿中，随机分为正常组，模型组和龙眼肉提取物组。除正常组常规培养外，其余各组采用200 μM H2O2处理细胞8 h，给药组加入H2O2前先加受试药物预处理2 h。经H2O2处理12 h后，流式细胞仪检测细胞凋亡。每组3个复孔。

1.2.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计。组间比较采用单因素方差分析和t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 龙眼肉不同提取物对细胞增殖的影响 MTT法检测结果（图1）表明，细胞存活率模型组较正常组降低（P<0.05），龙眼肉水提取物0.5、1.0 mg/mL和正丁醇提取物1.0 mg/mL组较模型组提高（P<0.01）；正丁醇提取物0.5 mg/mL、乙酸乙酯提取物和阳性对照石杉碱甲（2 μM），实验浓度范围内未见神经保护作用（P>0.05）。结果提示，实验浓度范围内，龙眼肉水提取物促进细胞增殖作用最明显。

2.2 龙眼肉不同提取物对SOD、MDA水平的影响 图2A结果表明，SOD活力，模型组较正常组SOD降低（P<0.05）；龙眼肉水和正丁醇提取物组较模型组提高（P<0.05，P<0.01）；乙酸乙酯提取物组与模型组比较无差异但有升高趋势。图2B结果表明，MDA含量模型组较正常组增加但无显著差异；龙眼肉不同提取物对MDA含量亦无明显影响。结果提示，实验浓度下，龙眼肉水提取物抗氧化能力最强。

水、正、乙分别代表水、正丁醇和乙酸乙酯提取物；0.5、1.0代表给药浓度0.5、1.0 mg/mL；石杉代表石杉碱甲 2 μM。

2.3 龙眼肉不同提取物对细胞凋亡的影响

由图3可见，龙眼肉不同提取物均可使受损细胞活细胞数提高（P<0.01，图3B）、早期凋亡细胞减少（P<0.01，P<0.05，图3C）；对晚期凋亡及细胞坏死，仅乙酸乙酯部位有明显作用。

3 讨论

高分化PC12细胞因具有神经内分泌细胞的一般特征，被广泛应用于神经系统疾病研究。Aβ和H2O2均具有细胞毒性，可诱导细胞氧化应激损伤。因Aβ沉积是阿尔茨海默病（AD）的主要病理特征之一，氧化应激又是导致AD的一个重要诱因，故Aβ和H2O2常被用于构建体外AD细胞模型。作者前期采用H2O2诱导PC12细胞损伤，用龙眼肉不同提取物进行干预，结果表明，龙眼肉水、正丁醇及乙酸乙酯提取物对细胞存活均有一定的保护作用，实验浓度范围内，以乙酸乙酯提取物促进细胞增殖作用最明显，并且其对H2O2诱导的细胞凋亡有一定抑制作用[9]。但是，不同提取物对Aβ诱导的体外AD模型是否有保护作用以及不同提取物对H2O2诱导的细胞凋亡的比较研究前期均未报道。本研究采用Aβ和H2O2诱导建立PC12细胞损伤模型，并探讨龙眼肉不同部位的神经保护作用。综合本实验结果并联合前期实验结果，作者推测，龙眼肉不同极性部位均有神经保护作用，但作用机制不完全相同：水和正丁醇提取物主要是提高细胞抗氧化能力，抑制早期细胞凋亡；乙酸乙酯提取物主要是抑制细胞各期凋亡及坏死。

参考文献

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