醒脑益智剂联合罗格列酮改善2型糖尿病小鼠记忆障碍的作用机制

毛黎黎 高晓斐 岳仁宋

【摘 要】 目的：研究醒脑益智剂联合罗格列酮对2型胰岛素抵抗型糖尿病痴呆小鼠学习记忆能力及胰岛素信号通路的影响及其作用机制。方法：雄性10周龄C57BL小鼠16只为正常对照组，雄性10周龄KKay小鼠80只为模型组，高糖高脂饲料喂养8周后，随机血糖≥13.9mmol/L为模型成立，随机分为模型对照组、阳性对照组和联合给药高、中、低剂量组。阳性组每日用马来酸罗格列酮片（0.003g/kg）灌胃，联合给药高、中、低剂量组每日分别用马来酸罗格列酮片（0.003g/kg）和醒脑益智剂（3.6、7.2、14.4g/kg）灌胃，对照组每日用等体积生理盐水ig，连续42 d。给药前后分别行1次Morris水迷宫实验，最后1次水迷宫后立即在冰具上采集样本，检测小鼠大脑皮层及海马中PI-3K/Akt的蛋白表达水平以及GSK-3β（糖原合酶激酶-3β）、Tau蛋白及P-Tau（Tau蛋白磷酸化）水平。 结果：与正常组相比，模型组小鼠的平台潜伏期明显偏高（P<0.05），PI-3K活性明显偏低（P<0.05），GSK-3β和p-Tau水平均明显偏高（P<0.05），联合给药组各项指标与正常组无明显差异。与模型组相比，阳性组与之各项指标差异均不明显，联合给药组平台潜伏期均明显偏低（P<0.05），PI-3K/Akt活性均明显偏高（P<0.05），GSK-3β和P-Tau水平均明显偏低（P<0.05），其中以联合给药中剂量组效果最为明显。给药后各组间Ins R水平差异不大。 结论：在常规改善胰岛素抵抗的基础上，醒脑益智剂能有效提高2型糖尿病痴呆小鼠学习、记忆能力，其可能的作用机制为改善大脑海马胰岛素信号传导通路，增强PI-3K活性，降低GSK-3β表达和Tau蛋白磷酸化水平。

【关键词】 醒脑益智剂；糖尿病性记忆障碍；GSK-3β；Tau蛋白；PI-3K

【中图分类号】R965 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）11-0014-05

Abstract：Objective To study the effect and mechanism of Xingnao Yizhi prescription with Rosiglitazone on memory impairment of type 2 diabetes. Method Sixteen 10-week C57BL mice were as normal group and 80 Kkay mice 10- week with high blood sugar （≥13.9 mmol/L） as model group，positive group and composite group with high，middle and low doses. Fed the positive group was given rosiglitazone maleate tablets （0.003 g/kg） ，and composite group was given rosiglitazone maleate tablets （0.003g/kg） and Xingnao Yizhi prescription （3.6、7.2、14.4 g/kg） . Normal and model groups were given equal volume of saline. After two Morris water mazes，samples were collected and immunohistochemical method was used to test 1-phosphatidylinosital 3-kinase （ PI-3K） / Akt and western blotting was used to test glycogen synthase kinase -3， Tau protein and phosphorylation of Tau protein. Result Compared with normal group，model group used much longer time to find the plat （P<0.05） ，had less active PI-3K （P<0.05） and more active GSK-3β and p-Tau， no significant differences in the composite group and normal group. Compared with control group，there was no significant differences in positive group，while PI-3K/Akt， GSK-3β and P-Tau were contrary in composite group （P<0.05）.Conclusion Xingnao Yizhi prescription can improve the study and memory level of type 2 diabetes mice with cognitive impairment based on the reducing of plasma insulin，and the possible mechanism may enhance the activity of PI-3K， and reduce the level of GSK-3β， P-Tau.

Keywords：Xingnao Yizhi Prescription；Diabetes Memory Impairment；GSK-3β；Tau；PI-3K

糖尿病性记忆障碍也可称为“3型糖尿病”[1-2]，是老年期癡呆中较为常见的一种慢性进行性中枢神经系统性病变[3-4]。根据长期的临床观察发现，本病多以肾虚为本，痰浊、血瘀为标[5-6]，从而确立了以“胰-肾-脑”轴为指导的补肾醒脑法，现已制成院内合剂-醒脑益智剂，但其作用机制尚未明确。故本实验在建立稳定的2型糖尿病性记忆功能障碍小鼠模型的基础上，进一步观察并明确醒脑益智剂对2型糖尿病性记忆功能和大脑胰岛素信号传导通路的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物 中药处方包括熟人参、地黄、川芎、粉葛、冰片、山药等，由成都中医药大学附属医院药剂科提供并制备。阳性对照品为马来酸罗格列酮片[商品名文迪雅，葛兰素史克（天津）有限公司，国药准字H20020475]，购于成都中医药大学附属医院。

1.2 试剂 Western Blot一抗购自Cellsignal公司，二抗购自北京博奥森生物公司。

1.3 动物 SPF级雄性10周龄健康C57BL小鼠16只，体重26～35 g；SPF级雄性10周龄健康KKAy小鼠80只，高脂高糖饲料（10%蔗糖、10%脂肪、基础饲料）喂养8周，血糖稳定后改为基础饲料喂养。以上动物及饲料均由中国医学科学院实验动物研究所提供[许可证号SCXK（京）2009-0004]。实验中动物自由摄食及饮水，取材前禁食12 h，温度（23±2）℃，相对湿度26%～29%。

1.4 仪器 One-Touch-II快速血糖仪及血糖试纸（美国强生公司）；显微镜（日本奥林巴斯BX51T-PHD-J1）；多功能真彩色细胞图象分析管理系统（Image-Pro Plus，美国Media Cybernetics 公司）；医用X射线胶片（柯达公司，美国）。

1.5 方法

1.5.1 造模和分组 C57BL小鼠16只，由基础饲料喂养，为正常对照组。Kkay小鼠80只，高糖高脂饲料喂养6周后检测随机血糖≥13.9 mmol/L为造模成功，随机分为模型对照组、阳性对照组和联合给药高、中、低剂量组，每组16只。

1.5.2 给药 阳性组每天用马来酸罗格列酮片按小鼠体重（0.003 g/kg）灌胃，联合给药大、中、小剂量组每日分别用马来酸罗格列酮片（0.003 g/kg）和醒脑益智剂生药（3.6、7.2、14.4 g/kg）灌胃，正常组和模型组每天用等体积生理盐水灌胃，持续42 d。

1.5.3 Morris水迷宫实验 分组前及给药后各进行一次。前4天为隐藏平台实验，限定时间90 s，若小鼠找到平台，使之于平台休息30 s；如90 s未找到平台，将小鼠捞起并放于平台休息30 s，并将时间记录为90 s。第5天为空间搜索实验，撤除平台，记录小鼠在90 s内第1次找到平台区的时间及找到平台的次数。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。

1.5.4 取材及标本制作

1.5.4.1 免疫组化样本 水迷宫试验结束后，抽签法每组选取8只小鼠，0.1% DCPC（0.1%去乙酰头孢菌素C）溶液处理并高压蒸汽消毒相关手术器械，按小鼠体重3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，生理盐水经左心室灌注后取全脑，4 ℃4%多聚甲醛固定24 h，取包括海马、大脑额叶皮质进行脱水、透明、浸蜡、包埋后连续冠状切片。

1.5.4.2 Western blotting样本 水迷宫试验结束后，抽签法每组选取8只小鼠， 3.5%水合氯醛按3mL/kg腹腔注射麻醉后无菌操作开颅取海马、大脑额叶皮质，匀浆后取上清液制备Western Blotting样本。

1.5.5 检测方法

1.5.5.1 每周1次断尾取血法监测血糖。

1.5.5.2 免疫组化方法 检测小鼠海马组织中PI-3K/Akt蛋白活性。先采用100倍显微镜观察小鼠大脑海马区，每个样本取6张相同部位的脑切片，然后在200倍光镜下选择5个相邻视野对阳性细胞（棕黄色胞浆）进行观察，最后采用Image-Pro Plus软件测定光密度值。

1.5.5.3 Western Blotting 检测小鼠海马组织中GSK-3β的活性、Tau蛋白总量及Tau蛋白磷酸化水平。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，并分离蛋白，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上加一抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗，充分显影曝光并照相保存。

1.5.6 统计学分析 应用SPSS17.0统计软件进行分析，实验数据以均数加减标准差（x±s）表示，采用方差分析并进行组间两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体重和血糖 给药前Kkay小鼠体重（g）和血糖（mmol/L）均明显大于正常对照组C57BL小鼠体重（P<0.05）；给药后，正常组血糖水平变化不大，模型组血糖水平明显升高并高于其他各组，差异有统计学意义（P<0.05）。相较于正常组C57BL小鼠，转基因KKay小鼠养至第18周龄时即已出现轻度记忆障碍，并随时间推移、血糖升高而逐渐加重且波动不大，说明其作为2型糖尿病性记忆障碍模型已成熟稳定。见表1。

2.2 Morris水迷宫实验结果 给药后潜伏期比较，联合给药组和正常组第5天比第1天明显缩短，且明显小于模型组和阳性组；平台象限概率比较，联合给药组和正常组明显大于模型组和阳性组。差异均有统计学意义（P<0.05）。说明在使用罗格列酮改善胰岛素抵抗的基础上，醒脑益智剂可有效改善2型糖尿病小鼠的学习和记忆功能。见表2。

2.3 Western blotting实验结果 各组小鼠大脑海马中Tau蛋白总量差异不大。与模型组相比，正常组和联合给药组在Ser396位点上Tau蛋白磷酸化水平明显偏低，GSK-3β活性明显偏高，差异均有统计学意义（P<0.05）。Tau蛋白的过度磷酸化是2型糖尿病性记忆障碍重要的病理改变[8]，而GSK-3β活性升高是其主要原因。在改善胰岛素抵抗的基础上，醒脑益智剂可以有效降低GSK-3β活性并纠正Tau过度磷酸化水平。见表3。

2.4 免疫组化结果 模型组和阳性组PI-3K/Akt染色阳性表达不明显，正常组PI-3K/Akt染色陽性表达增多，差异有统计学意义（P<0.05），其主要表现为胞浆甚至细胞核呈黄褐色；与模型组和阳性组相比较，联合给药组PI-3K/Akt阳性细胞染色强度及阳性细胞分级均明显高于模型组和阳性组，差异有统计学意义（P<0.05）。这说明醒脑益智剂能有效增强海马中PI-3K活性表达，而PI-3K活性的异常降低是引起GSK-3β活性升高和Tau过度磷酸化的关键因素。见表4。

3 讨论

脑内胰岛素功能复杂，其水平异常是促使记忆障碍发生的重要原因[8-12]。2型糖尿病是引发痴呆的重要因子之一，其可能的发病机制为大脑皮质及海马中存在PI-3K活性的降低、GSK-3β活性增高和Tau蛋白的过度磷酸化[8]，即胰岛素抵抗产生的信号传导障碍[9]。胰岛素信号系统功能低下时，会导致下游途径中磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）下降，从而导致Tau蛋白磷酸化的主要糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）活性增高[13-14]。因此，研究不同的胰岛素水平对PI-3K活性以及Tau蛋白过度磷酸化程度的影响，从分子水平上解释糖尿病与记忆障碍的关系及致病机制，并在组织细胞凋亡的同时预防和延缓神经细胞的退行性变方面都具有重要的意义[15]。

在临床上，张发荣教授以脑为轴心的“胰（脾）-脑-肾轴”的消渴呆病病机学说为基础，广泛运用补肾醒脑法治疗老年性痴呆（包括血管性痴呆），取得较好疗效[16]。《灵枢·海论》云：“脑为髓之海，诸髓皆属于脑”。肾主藏精，为先天之本，是脑髓生成的物质基础，故有“肾生脑”之说。消渴日久，阴虚燥热，灼精耗液，脾肾亏耗，损及脑髓。在消渴呆病的发病环节中，根源为脑髓空虚，本质是肾精亏虚，始动因子为胰（脾）。治疗以补肾醒脑为根本大法，在控制血糖的基础上，以阻止智能衰减为最终目标，在《备急千金要方》所载开心散及张锡纯《医学衷中参西录》所载滋脺饮的基础上，结合多年临床实践，形成了醒脑益智剂。

在临床观察研究的基础上，研究在胰岛素抵抗状态下动物模型的记忆功能及海马PI-3K、GSK-3β的活性和Tau蛋白过度磷酸化的修饰水平发现，醒脑益智剂可有效提高2型糖尿病性记忆障碍小鼠的学习、记忆能力，增强大脑皮质及海马组织中PI-3K表达，降低GSK-3β活性，纠正Tau蛋白的过度磷酸化，改善大脑组织中胰岛素信号传导通路，这也为祖国医学进一步防治糖尿病性记忆障碍提供了理论依据。

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