重楼醇提物对三种神经胶质瘤细胞株的细胞毒性研究

周国灿 李晓倩 曾洪波

【摘 要】 目的：通过重楼醇提物对三种人神经胶质瘤细胞株（U251、U87、T98G）进行细胞毒性检测，观察重楼醇提物的抗肿瘤活性。方法：乙醇冷浸法对重楼饮片进行提取，采用聚酰胺柱层析分离划段获得重楼醇提物的不同部位，通过MTT法对所得部位进行细胞毒性检测。 结果：重楼醇提物中有3个分离组分作用于人神经胶质瘤细胞IC50值小于10μg/mL，对神经胶质瘤细胞株表现出明显的细胞毒性作用。 结论：重楼醇提物中存在抑制神经胶质瘤细胞株增殖的物质，值得进一步开展相关研究。

【关键词】 重楼；醇提物；胶质瘤细胞；MTT；细胞毒性

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）01-0041-03

Abstract：Objective To explore the cytotoxicity induced by paridis ethanol extract on three kinds of glioma cells （U251，U87，T98G）. Methods The ethanol cold-maceration method is used to extract the anti-tumor active components from paridis. The samples are obtained with polyamide column chromatography separation from the paridis ethanol extracts. The cytotoxicity of samples is assessed by MTT assay.Results There are three samples showing strong cytotoxic effect and some of them have the 50% inhibition concentration （IC50） less than 10.0μg/mL. The cytotoxicity analysis shows the paridis ethanol extract having anti-tumor activities. Conclusion Paridis ethanol extract displays an inhibitory effect on these three kinds of glioma cells in vitro and it is worthy further research.

Keywords：Paridis； Ethanol Extract； Glioma Cell； MTT； Cytotoxicity

重楼来源于百合科植物云南重楼Paris polyphylla [JP]Smith var.yunnanensis （Franch.）Hand.-Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis （Franch.） Hara的干燥根茎[1]。其性苦、微寒，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊、止咳平喘的功效，在痈肿疔疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、抽搐惊风、跌打扭伤等症治疗中均有很好的疗效。扶正、祛邪是传统中医药在肿瘤治疗方面的两大基本原则，其中清热解毒为最主要的祛邪手段之一[2]。重楼组方对恶性肿瘤的热症及实症有一定的治疗效果，在恶性肿瘤治疗方面的作用越来越受到研究者的关注，重楼对正常细胞毒性较小、抗肿瘤谱广，重楼水提物、醇提物及其主要活性成分重楼皂苷和一些重楼单体（如皂苷I、Ⅱ、IV、gracillin、methylmotogracillin、重楼皂苷D等）在体外对食管癌、胃癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌等多种实体癌均有较强的细胞毒性作用[3]。研究应用乙醇冷浸法对重楼饮片进行提取，通过聚酰胺柱层析分离划段獲得重楼醇提物的不同分离部位样品，改良MTT法对人类神经胶质瘤细胞株（U251、U87、T98G）进行细胞毒性检测，二甲基亚砜（DMSO）设为空白对照组，顺铂（DPP）为阳性对照组，对活性测试结果进行分析比较，初步探讨重楼醇提物的体外抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 细胞株与实验试剂 人神经胶质瘤细胞株（U251、U87、T98G）购自中国科学院上海细胞库；RPMI-1640培养基（Gibco公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；顺铂（DDP，山东齐鲁制药厂）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、EDTA、胰蛋白酶、DPBS均购自江苏碧云天生物技术有限公司；其余有机试剂均为国产分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器 XD-2型倒置相差显微镜（日本Olympus）；Synergy-HT型酶标仪（美国Bio-Tek公司）；2306-2型CO2培养箱（美国Shellab公司）；ZW-AZ型微量振荡器（常州国华电器有限公司）；SC-3610型台式低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；96孔细胞培养板（美国Corning公司）。

1.3 重楼醇提物制备 重楼饮片（产自云南丽江），饮片中加入15倍体积的70%乙醇熬煮3遍，每次2h，所得乙醇液合并后浓缩，石油醚脱脂，待其挥发干燥后称浸膏重。

1.4 样品的配制 重楼实验组样品：取20g重楼浸膏水溶后上聚酰胺柱，分别用水及不同比例的含水甲醇洗脱，定量收集，分别浓缩纯化后冷冻干燥，共获得13个部位的样品，编号为RL01～RL13。取样品1mg加入20μL DMSO使其溶解，再用RPMI-1640培养基稀释成质量浓度为75、25、8.33、2.78μg/mL的样品溶液。

阳性对照组样品：使用RPMI-1640培养基将质量浓度为1mg/mL的DDP溶液稀释，分别配制成质量浓度为10.00、3.33、1.11、0.37μg/mL的样品。

1.5 细胞毒性检测 将人神经胶质瘤U251、U87、T98G細胞株分别置于含10%新生牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞达到80%～90%融合时，0.25%胰蛋白酶消化传代，选用第3代神经胶质瘤细胞做细胞毒性实验研究，调整细胞浓度为 2×105/mL，将细胞重悬后接种于96孔板中，每孔100μL，培养24h后在每个实验孔中分别加入50SμL测试样品溶液，每个浓度样品设3个复孔，同时设置空白对照组（DMSO） 和阳性对照组（DDP），继续培养 48h后，于每个实验孔中加入10μL 预先用生理盐水配制好的MTT 检测液，培养箱中继续孵育 6h，沿培养孔边缘轻柔将上清液吸去，实验孔中分别加入DMSO 100μL，培养板放置于微量振荡器上，振荡 5min直至甲臜完全溶解，使用酶标仪 在570nm 处测定吸光度OD值，使用下面的公式计算样品对肿瘤细胞的生长抑制率，抑制率（%）= （OD空白-OD样品） / OD空白×100%，通过SPSS 13.0统计软件计算获得IC50值。

2 结果

用聚酰胺层析分离划段所得的重楼醇提物13个部位样本中，除编号为RL01～RL03及RL13样品对所选三株神经胶质瘤细胞均没有抑制作用外，RL04～RL12样品至少对一株神经胶质瘤细胞表现出细胞毒性作用。RL06～RL08样品对三株胶质瘤细胞均表现出较强的细胞毒性效应。就同一部位而言，三种神经胶质瘤细胞株的细胞毒性相差较大，表明活性部位对不同类型肿瘤细胞的抑制（或杀灭）作用具有一定的选择性。在三株神经胶质瘤细胞中，活性部位对U251的细胞毒性强于U87和T98G细胞，同时高活性部位（RL07）的半数抑制浓度（IC50）值已达到阳性药物顺铂（DPP）的三分之一，作为药物的粗提部位，已经具有了较强的细胞毒活性。结果见表1。

表中数据为4次重复实验的平均值，“-”表示IC50值大于100μg/mL，认为无明显细胞毒活性，表中未列出数据。

3 讨论

神经胶质瘤是一类发生于神经外胚层的中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，神经胶质瘤侵袭快、治愈率低、细胞具有异质性，其发病率、复发率及死亡率常年居高不下。在原发性肿瘤中神经胶质瘤的比例高达40%～60%[4]。依据分化程度的差异，神经胶质瘤可分为星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜细胞瘤和少突胶质细胞瘤等，其中胶质母细胞瘤及星形细胞瘤的患者，术后一年内最大生存率仅为5%[5]。目前，神经胶质瘤主要的治疗手段有手术、放疗及化疗，胶质细胞瘤具有分化程度低、侵袭性强及增殖迅速的特点，常规手术治疗手段不能彻底切除肿瘤细胞。随着放疗时间的延长，肿瘤细胞对辐射的敏感性下降，从而增加了残存病灶复发的概率。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性、个体对药物的敏感性、肿瘤及周边水肿组织间隙的静水压高等因素都使得神经胶质瘤患者的化疗效果不佳[6]。恶性胶质瘤尤其是低分化胶质瘤手术治疗的局限性，使神经胶质瘤术后复发率和死亡率都很高，一般而言，患者术后平均生存时间常不超过一年，因此，怎样将神经胶质瘤细胞彻底清除仍然是研究人员面临的一大难题，寻找疗效好、副作用小的化疗药物是当今神经胶质瘤治疗中的主要研究方向之一。

中药重楼及其活性成分主要通过以下机制发挥抗肿瘤作用：①抑制肿瘤细胞增殖诱导肿瘤细胞凋亡；②抑制肿瘤血管生长；③调节机体免疫功能；④逆转肿瘤细胞多药耐药性[7]。重楼醇提物、水提物对人肺腺癌（A549）、人胰腺癌（PANC-1）、人结肠癌（SW480）、人肾腺癌（A496）、人乳腺癌（MCF-7）、人前列腺癌（PC-3）等多种类型的肿瘤细胞均有细胞毒作用。重楼中甾体皂苷、植物蜕皮激素、植物甾醇等甾体类化合物含量丰富，其中甾体皂苷是其主要的活性物质[8]。孙治国等[9]报道，醇提物比水提物提取出的重楼总皂苷更多，且70%乙醇提取总皂苷的获得率最高。因此，研究采用70%乙醇冷浸法对重楼饮片进行提取，通过聚酰胺柱层析分离划段得到重楼醇提物，共获得13个样品，结果发现重楼醇提物中不同活性部位的抗肿瘤活性具有一定差异。但当中药抗肿瘤部位活性测试结果IC50值小于10.0μg/mL时，有价值对其进行进一步开展研究。体外研究结果初步证实，重楼醇提物确实存在具有对神经胶质瘤细胞抑制（或杀灭）作用的活性物质，重楼醇提物对神经胶质瘤治疗的临床意义值得进一步的研究探讨。

参考文献

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[2]冯英楠，陈菲，庄伟，等.中医药治疗胶质瘤的研究进展[J].北京中医药，2014，33（2）： 154-157.

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[8]朱燕，谢丽，杨觅，等. 重楼抗肿瘤机制的研究进展[J]. 癌症进展， 2015， 13 （2） ： 164-166.

[9]孙治国， 张琳，李凌军，等. 重楼总皂苷提取工艺研究[J]. 中药材，2007， 30（6） ： 726-729.

（收稿日期：2017-11-21 编辑：穆丽华）