罗氏沼虾病原阴沟肠杆菌药物敏感性测定与分析

李席席，皮大明，高晓建，陈 楠，刘晓丹，张莹莹，付立霞，叶金明，张晓君

(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.扬州市水产生产技术指导站，江苏扬州 225101)

罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)是原产于印度洋太平洋地区的一种淡水虾类，其生长速度较快，当年繁殖虾苗经 3—5个月养殖即可达上市规格，具有极高的经济价值，目前已经成为内陆重要的水产养殖对象，我国也已成为全球罗氏沼虾最大养殖国[1]。在罗氏沼虾产业发展过程中，苗种质量、水质环境、病害等已成为主要的制约因素。近年，我国南方多家罗氏沼虾苗种场在幼体培育阶段发生暴发性死亡，幼体表现为食欲下降空胃，体色发黑发红，活力下降不能正常蜕皮变态。该病在幼体培育初期即开始发病，持续整个培育期，使得育苗产量严重下降，经济损失巨大[2]。2017年春季，江苏省高邮市部分罗氏沼虾育苗场发生罗氏沼虾幼体大规模死亡现象，将发病的幼体用氧气袋运输至实验室，经表型和分子生物学鉴定引起多家育苗场幼体大批死亡的病原之一为肠杆菌属(Enterobacter)的阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)。

阴沟肠杆菌是人肠道致病菌，在机体抵抗力下降时，可引起呼吸系统、泌尿系统、伤口及败血症感染，已构成医院内感染的一种重要病原菌[3]；有资料表明该菌对鸡、猪等动物具有致病作用，主要是引起以腹泻为主要症状的感染[4]。近年来有关该菌对水产动物的致病性也有报道，Seker 等[5]报道了阴沟肠杆菌对健康鲻 (Mugilcephalus)具有较强的致病性，鲻感染该菌会造成大量死亡，陈雪峰等[2]报道了阴沟肠杆菌是导致2010 年浙江湖州某几个罗氏沼虾育苗场幼体大规模发病死亡的致病菌。本研究采用纸片扩散法(K-B法)测试了分离的罗氏沼虾病原阴沟肠杆菌对35种抗菌类药物的敏感性，同时采用试管稀释法测定了6种抗菌药物对对阴沟肠杆菌的MIC和MBC，为罗氏沼虾育苗生产中阴沟肠杆菌的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

2017年春季江苏省高邮市部分罗氏沼虾育苗场幼体及仔虾出现大批死亡，发病幼体及仔虾表现为活力减弱，身体微红。将发病罗氏沼虾幼体用氧气袋打包运输到实验室，从不同育苗场罗氏沼虾中分离出5株阴沟肠杆菌,编号为：XL1、XL2、LW1、WJ1、GXFL1。

1.1.2 实验药品

药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司；6种抗菌药物购自北京索莱宝科技有限公司，品名批号见表1。

表1 供试用药物Tab.1 The test drugs

目前红霉素、头孢曲松以及诺氟沙星在生产上已经被列为渔用禁药，仅为实验研究提供参考。盐酸土霉素、氟苯尼考以及恩诺沙星是生产上常用的三种抗菌药物。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌分离

取发病幼体及仔虾，用生理盐水清洗后做匀浆处理，无菌操作取匀浆液划线接种于普通营养琼脂，于28 ℃恒温培养24 h，选取优势生长的单菌落进行重复划线纯培养，于4 ℃冰箱保存备用。分离菌株经表型特征、理化特性及分子生物学鉴定为阴沟肠杆菌。

1.2.2 药敏实验

采用常规琼脂扩散(K-B)法对35种抗菌类药物的敏感性进行测定，将供试的5株阴沟肠杆菌纯培养物分别接种于普通营养肉汤，在28 ℃，160 r/min摇床培养24 h后，在普通营养琼脂平板上加入100 μL菌液并涂布均匀，待自然晾干后，再用灭菌眼科镊取药敏纸片分别平贴于涂布细菌的培养基表面，每个平板贴6张纸片，重复三次，置28 ℃培养24 h测量抑菌圈直径，对照产品说明书判定敏感性。

1.2.3 制备菌悬液

将菌株WJ1接种于普通营养肉汤中，置28 ℃培养24 h，采用平板计数法将菌液浓度调整为108CFU/mL，然后采用倍比稀释法将菌液稀释到106CFU/mL。

1.2.4 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定

首先用灭菌生理盐水将供试药物原液稀释到2×10-1mg/mL，共设14个浓度(mg/L=g/m3)，采用逐级稀释法[6]，使各管药液终浓度为30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 mg/L。然后加入0.1 mL浓度为106CFU/mL的活菌液WJ1，每个浓度设3管重复，第15管为不加药液的阳性对照。轻摇混匀使被测菌与药液充分接触，置28 ℃培养24 h后，肉眼观察呈现澄清且摇动后仍澄清者，则表示无细菌生长(被抑制)，若呈混浊状态则表示有细菌生长(无抑制)。无细菌生长的最大稀释度的药液，即为该药物的最小抑菌浓度。从澄清的试管中吸取0.1 mL，涂布于普通营养琼脂平板，28 ℃培养48 h后，仍无细菌生长的最低药物浓度为供试药物对细菌的最小杀菌浓度[7]。

2 结果

2.1 5株阴沟肠杆菌对35种抗菌类药物的敏感性

纸片扩散法测定5株阴沟肠杆菌对供试35种抗菌类药物敏感性结果见表2。结果表明：5株阴沟肠杆菌对青霉素类药物、磺胺类药物、呋喃类药物的敏感性最差，对头孢菌素类中的头孢吡肟、氨基糖苷类中的阿米卡星、四环素类中的米诺环素、单环内酰胺中的氨曲南的敏感性最好，对喹诺酮类药物中的诺氟沙星、氨基糖苷类药物中的庆大霉素和妥布霉素以及链霉素和卡那霉素、酰胺醇类药物中的多粘菌素B敏感性次之，此外，5株阴沟肠杆菌对青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、酰胺醇类这七大类药物的耐药性都存在株间差异现象。

表2 阴沟肠杆菌对35种抗菌药物的敏感性Tab.2 The antimicrobial sensitivity of pathogenic E.cloacae to 35 drugs

注：S为敏感；I为中度敏感；R为耐药；D为株间差异。

2.2 6种药物对菌株WJ1的最小抑菌浓度

6种药物对阴沟肠杆菌的最小抑菌浓度见表3。结果表明盐酸土霉素的最低抑菌浓度为4 mg/L，氟苯尼考的最低抑菌浓度为5 mg/L，诺氟沙星的最低抑菌浓度为3 mg/L，头孢曲松的最低抑菌浓度为25 mg/L，在供试6种药物中，恩诺沙星对阴沟肠杆菌的抑菌效果最好，在1～30 mg/L的药物浓度范围内均无菌体生长，其次是诺氟沙星；盐酸土霉素和氟苯尼考的抑菌效果仅次于诺氟沙星，头孢曲松的抑菌效果比盐酸土霉素、氟苯尼考和诺氟沙星要差一些；其中红霉素的抑菌效果最差，在所设置的药物浓度范围内均有菌体生长。

供试验所用的6种药物对阴沟肠杆菌的抑菌效果由强到弱依次为：恩诺沙星、诺氟沙星、盐酸土霉素、氟苯尼考、头孢曲松、红霉素。

表3 6种抗菌药对阴沟肠杆菌的最小抑菌浓度(MBC)Tab.3 The minimum bactericidal concentration of six kinds of antimicrobial drugs to E.cloacae

注：表中“-”表示无细菌生长，“+”表示有细菌生长。表4同。

2.3 6种药物对菌株WJ1的最小杀菌浓度

6种常用药物对阴沟肠杆菌的最小杀菌浓度见表4。结果表明盐酸土霉素的最小杀菌浓度为8 mg/L；氟苯尼考的最小杀菌浓度为10 mg/L；恩诺沙星的最小杀菌浓度为4 mg/L；诺氟沙星的最小杀菌浓度为7 mg/L；综合上述研究结果，在供试的6种药物1～30 mg/L浓度范围内，恩诺沙星对阴沟肠杆菌的杀菌效果最好，使用较低的药物浓度即可杀死病原阴沟肠杆菌；其次是诺氟沙星；盐酸土霉素的杀菌效果也相对明显，仅次于诺氟沙星；而氟苯尼考的杀菌效果略差于盐酸土霉素，红霉素和头孢曲松2种药的杀菌效果最差。

表4 6种抗菌药对阴沟肠杆菌的最小杀菌浓度(MBC)Tab.4 The minimum bactericidal concentration of six kinds of antimicrobial drugs to E.cloacae

注：表中“-”表示无细菌生长，“+”表示有细菌生长。

3 讨论

抗菌类药物是治疗水产动物细菌性感染的有效技术性手段之一，目前，抗菌药物在水产动物疾病防治中多有报道。姜光明等[8]研究了9种抗菌类药对中华绒螯蟹和克氏原螯虾的病原菌维氏气单胞菌以及弗氏柠檬酸菌的抑菌效果，发现其对氟苯尼考、盐酸环丙沙星、乳酸诺氟沙星、盐酸诺氟沙星的等4种抗生素敏感。韦信贤等[9]从临死的山瑞鳖组织中分离出1株致病性细菌，抑菌结果表明该菌对16种抗菌药物中的阿米卡星、氧氟沙星、恩诺沙星药物敏感，对头孢哌酮、庆大霉素、诺氟沙星中度敏感，对氨苄青霉素等10种抗生素均存在不同程度的耐药。薛慧娟等[10]研究了喹诺酮类药物对从临床上分离的59株嗜水气单胞菌的耐药性，结果显示分离的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药程度不一，其中萘啶酸的耐药最为严重，诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星敏感性较高。本实验研究了35种抗菌类药物对从濒临死亡的罗氏沼虾体内分离的5株阴沟肠杆菌的抑菌效果，结果表明菌株对青霉素类药物、磺胺类药物、呋喃类药物的敏感性最差，而对头孢菌素类中的头孢吡肟、氨基糖苷类中的阿米卡星、四环素类中的米诺环素、单环内酰胺中的氨曲南的敏感性最好。

恩诺沙星属第三代氟喹诺酮新药，具有良好的抗菌活性，而且杀菌力强、吸收快，被广泛用于鱼虾类养殖行业[11]，国外的研究结果也表明，恩诺沙星不仅在鱼体内残留消除的速度相对较快而且对水产动物的病原菌有良好的抑杀能力[12-13]。此外，本研究中，恩诺沙星对阴沟肠杆菌的杀菌效果最好，因此可首选恩诺沙星防治渔业生产上阴沟肠杆菌的爆发。盐酸土霉素是一种较为传统的人畜共用的抗生素，本实验中对阴沟肠杆菌的抗菌效果仅次于诺氟沙星。诺氟沙星是氟喹诺酮类抗菌药物的一种，具广谱抗菌作用，且抑菌能力强[14]，由于恩诺沙星对水产动物和水环境危害严重，现已被列为水产上的禁用药物。氟苯尼考是动物专用的氯霉素类新型广谱抗生素，在本次实验浓度范围内对阴沟肠杆菌效果不及恩诺沙星、诺氟沙星以及土霉素。在生产上也可以用于防治阴沟肠杆菌引发的罗氏沼虾幼体发病。由于氟苯尼考具有抗菌活性以及在水产病害防治过程中的安全性，将有助于罗氏沼虾养殖的可持续发展[15]。

抗菌药物的使用的确为水产养殖业避免了大量经济损失，但是随着抗菌药物长期并且大量使用，使得致病菌的耐药性逐渐凸显出来[16]。因此在预防与治疗水产动物细菌性病害的养殖生产实践中，要避免盲目大量的用药使病原菌产生抗药性，导致耐药性增强[17-18]。