FGF2通过MAPK信号通路影响奶牛乳腺分支形态变化

崔英俊，于广璞，汤云飞，孙 喆，张 莉

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

乳房腺体由具有分支形态的腺体小叶构成。妊娠早期乳腺分支阶段短侧枝形成，为分泌腺泡提供发育平台[1]。妊娠期腺泡细胞数量和功能分化决定后续产奶能力，分支形态发生是腺泡发育和泌乳前提。

乳腺分支体外研究普遍使用三维培养，有利于研究乳腺组织体内发育、形态发生和细胞外基质信号传导。Ⅰ型胶原是细胞外基质主要成分，在三维培养时为组织提供力学环境，参与细胞信号传导，增加相关乳蛋白合成持续性，还可保存和运输细胞外基质分泌的生长因子以应对组织损伤修复[2]。碱性成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor 2，FGF2）作为公认的诱导分支形态发生的细胞因子，广泛用于三维培养。

20世纪90年代，学者利用雌性小鼠乳腺类器官，使用I型胶原并添加相关细胞因子作三维培养，在体外重现乳腺导管发育后，该培养模型广泛用于研究肺、唾液腺、肾脏、血管和乳腺导管发育[3]。在国内研究中，该培养模型多应用于肺[4]、胰腺[5]、骨髓间充质干细胞培养[6]，关于乳腺组织应用鲜有报道。以往乳腺分支研究多以小鼠为主，无法代替反刍动物乳腺分支情况。为明确FGF2诱导奶牛乳腺分支过程中涉及信号通路，本文利用青春期奶牛乳腺类器官作三维培养，利用FGF2诱导类器官分支，确定FGF2在奶牛乳腺分支过程中起作用的信号通路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 乳腺组织

采集无菌新鲜健康青春期荷斯坦奶牛乳腺组织，无菌生理盐水保存并迅速带回实验室。

1.1.2 主要试剂

Ⅳ型胶原酶购自VETEC公司；鼠尾Ⅰ型胶原购自Solarbio公司；DMEM/F12，FGF2，PD173074（FGFR1受体抑制剂）， LY-294002（PI3K/AKT通路抑制剂），U0126（MAPK/ERK通路抑制剂），ITS，DnaseⅠ内切酶等购自Gibco公司；一抗p-AKT、 AKT、p-ERK、 ERK、 GAPDH 购 自 CELL SIGNALING公司，RIPA（强）裂解液购自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺类器官获得及三维培养

将新鲜健康青春期荷斯坦奶牛乳腺组织剪成小块，加入DMEM/F12溶液（含1 mg·mL-1Ⅳ型胶原酶），37℃消化3 h，过滤。将滤液分装在预铺好2.5%BSA离心管中，1 500 r·min-1离心15 min，沉淀中加入2 000 U·mL-1的DnaseⅠ混匀静置5 min，重悬细胞沉淀，放入离心机中1 500 r·min-13～4 s，收集沉淀，对类器官计数。

在24孔板上预铺Ⅰ型胶原（pH 7.0～7.5），待Ⅰ型胶原完全凝固后，将类器官与Ⅰ型胶原（终浓度为3 mg·mL-1）混匀（1 000个类器官·mL-1Ⅰ型胶原），加入预铺24孔板。待完全凝固后，按照不同组别加入培养基。对照组培养基为含1%双抗，1%ITS的DMEM/F12培养基；FGF2组培养基在对照组基础上加入FGF2（终浓度50 ng·mL-1）。FGF2+PD173074组、FGF2+LY-294002组及FGF2+U0126组培养基则在FGF2组基础上分别加入PD173074（FGFR1抑制剂，10μmol·mL-1）、LY-294002（PI3K 抑制剂，10 μmol·mL-1）、U0126（MAPK/ERK抑制剂，10μmol·mL-1），置于37℃、5%CO2培养箱中培养84 h。随后用DFC280倒置相差显微镜观察类器官形态并拍照，每组随机挑选放大倍数为40倍的3个视野，每个视野内类器官总数均大于50个，计数。分支率计算公式：分支形态类器官/类器官总数×100%。

1.2.2 Western blot检验通路蛋白

D'Hank清洗孔板，每孔加RIPA裂解液100μL，4℃摇床过夜，之后14 000 r·min-1离心15 min，取上清。加入上样缓冲液，100℃加热10 min后超声3次，每次15 s。样品置于-80℃保存。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，将蛋白湿转至NC膜。用TBST洗膜，5%脱脂乳封闭。一抗4℃孵育过夜；二抗37℃孵育1～1.5 h。超敏发光液曝光。

1.2.3 数据分析

使用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对Western Blot结果扫描并作灰度分析；采用SPSS19.0软件对数据作单因素方差分析和显著性检验，每组3次重复，结果用“平均值±标准误（Mean±SEM）”表示，不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 奶牛乳腺三维培养形态学观察

对照组、FGF2组、FGF2+PD173074组、FGF2+LY-294002组、FGF2+U0126组作形态学观察，发现对照组、FGF2+PD173074组和FGF2+U0126组在84 h时无明显分支形态变化（见图1A、C、E）而FGF2组和FGF2+LY-294002组在培养84 h时具有分支形态学变化（见图1B、D箭头处）。

2.2 奶牛乳腺三维培养中分支率计算

计算各组分支率后，可知FGF2组在84 h时，分支率显著高于对照组（P＜0.05）；FGF2+LY294002组在84 h时，分支率显著高于对照组但低于FGF2组（P＜0.05）；对照组、FGF2+PD193074组和FGF2+U0126组在84 h时分支率无显著差异（P＞0.05）（见图2）。

图1 84 h时奶牛乳腺类器官在三维培养中形态学变化Fig.1 Morphogenesischangeof dairy cow mammary organoidsin three-dimensional cultureat 84 h

图2 奶牛乳腺类器官在三维培养中84 h时分支率Fig.2 Branching rateof dairy cow mammary organoids in three-dimensional cultureat 84 h

2.3 信号通路蛋白表达

0、15、60、240和600 min时各组AKT和ERK蛋白表达如图3、4、5所示，各组在各检测点AKT和ERK蛋白总量无显著差异（P＞0.05）。p-ERK和p-AKT蛋白表达如图6、7所示。Western blot结果表明，FGF2组p-AKT和p-ERK蛋白在0 min均未表达，但随培养时间延长p-AKT和p-ERK蛋白表达不断升高（见图6、7）。与FGF2组相比，FGF2+PD173074组p-ERK蛋白在0、15和60 min时无显著差异，240和600 min时p-ERK蛋白表达显著降低（P＜0.05）（见图7）；而p-AKT蛋白各时间点表达均显著降低（P＜0.05）（见图6）。与FGF2组相比，FGF2+LY-294002组p-ERK蛋白随培养时间延长，表达均显著降低（P＜0.05）；但在600 min时表达量显著高于FGF2+U0126组和FGF2+PD173074组（P＜0.05）（见图7）。FGF2+LY-294002组p-AKT相对表达水平在各时间点均显著低于FGF2组（P＜0.05）（见图6）。与FGF2组相比，FGF2+U0126组p-ERK蛋白表达在各时间点均显著降低（P＜0.05）（见图7）；FGF2+U0126组p-AKT蛋白表达在各时间点均显著低于FGF2组（P＜0.05），但均显著高于FGF2+LY-294002组和FGF2+PD173074组（P＜0.05）（见图6）。

图3 AKT和MAPK信号通路主要蛋白表达Fig.3 Expression of major proteinsin AKT and MAPK signaling pathways

图4 不同时间点AKT蛋白相对表达量Fig.4 Protein expression of AKT in different time point

图5 不同时间点ERK蛋白相对表达量Fig.5 Protein expression of ERK in different timepoint

图6 不同时间点p-AKT蛋白相对表达量Fig.6 Protein expression of p-AKT in different timepoint

图7 不同时间点p-ERK蛋白相对表达量Fig.7 Protein expression of p-ERK in different time point

3 讨论

3.1 FGF2对奶牛乳腺分支作用

FGF2可促进细胞分裂增殖[7]，参与包括小鼠乳腺上皮[8]、肺上皮[9]、唾液腺上皮[10]等多种组织分支形态发生。FGF2在乳腺导管上皮细胞、肌上皮细胞和腺泡上皮细胞中均有表达[11]。FGF2与乳腺分支形成密切相关，可控制小鼠乳腺导管延长，促进乳腺发育过程中细胞增殖和乳腺上皮扩张[12]。但FGF2对奶牛乳腺上皮分支作用未见报道。

本研究利用鼠尾Ⅰ型胶原镶嵌法对奶牛乳腺类器官三维培养，发现在FGF2作用下，与对照组相比，奶牛乳腺类器官84 h发生明显分支形态学变化，且分支率显著高于对照组，说明FGF2可使奶牛乳腺分支形成，与Kashimata等利用小鼠乳腺作三维培养结果一致[13]。

3.2 FGFR1对FGF2调节奶牛乳腺分支形态发生作用

FGF2受体为四种FGF受体酪氨酸激酶：FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。在青春期小鼠末端乳芽和乳腺导管上皮切片中，通过原位杂交可检测Fgfr1和Fgfr2RNA，但无Fgfr3和Fgfr4RNA表达[14]。Pond等研究表明，FGF受体（FGFR1和FGFR2）缺失导致有缺陷乳腺分支形态发生[15]。本研究在添加PD193074（FGFR1抑制剂）后，发现84 h时FGF2+PD193074组无明显分支形态发生，分支率显著低于FGF2组。通路蛋白检测中同样发现，FGF2+PD193074组p-ERK和p-AKT蛋白表达显著低于FGF2组。因此推断，FGF2在调节奶牛乳腺分支形态发生过程中，以FGFR1为主要结合受体。

3.3 MAPK通路对FGF2调节奶牛乳腺分支形态发生作用

FGF2与其受体结合后，一种途径是激活Raf/MAPK，Raf将信号转递给ERK1/2，活化ERK1/2将信号传递给核糖体激酶P90S6K和P70S6K，活化核糖体S6入核参与蛋白合成；另一个途径是激活AKT，将信号传递给JNK和ERK1/2，同样刺激核糖体活化，参与蛋白合成[16]。MAPK信号通路调节细胞增殖，分化，凋亡和细胞迁移[17]；AKT信号通路调节细胞存活、代谢、增殖、迁移[18]。在果蝇气管形成、小鼠颌下腺分支形态发生及小鼠乳腺试验中均证实MAPK信号通路与形态学发生有关[19]。可见在不同组织中，MAPK通路在分支形态形成过程中均为保守重要节点。目前MAPK通路调节分支延伸具体机制尚不清楚。本研究结果表明，在U0126抑制p-ERK蛋白表达时，84 h时FGF2+U0126组奶牛乳腺类器官分支率显著低于FGF2组和FGF2+LY-294002组，但与对照组相比差异不显著，证明MAPK/ERK信号通路是决定奶牛乳腺分支形态发生主要途径。

AKT和AKT下游JNK促进ERK1/2活化[20]，由此推断PI3K/AKT信号通路可能通过影响ERK活化影响奶牛乳腺分支形态。本研究结果发现，当LY-294002抑制p-AKT蛋白表达时，FGF2+LY-294002组的p-ERK蛋白表达显著高于FGF2+U0126组但低于FGF2组，表明LY-294002可能影响ERK磷酸化；形态学观察发现，FGF2+LY-294002组奶牛乳腺分支率显著高于对照组但低于FGF2组，表明PI3K/AKT信号通路可能影响奶牛乳腺分支形态。当U0126发挥作用时，即使p-AKT蛋白表达显著高于FGF2+LY-294002组，此时培养的奶牛乳腺类器官在形态学上并未观察到明显分支，说明PI3K/AKT信号通路并非奶牛乳腺分支形态产生主要途径，推测其单独作用难以影响奶牛乳腺分支形成。

4 结论

综上所述，利用FGF2在Ⅰ型胶原中成功刺激奶牛乳腺类器官产生分支结构。通过形态学观察和信号通路蛋白检测，明确FGF2通过FGFR1受体激活MAPK/ERK信号通路，对奶牛乳腺分支形成发挥作用。MAPK信号通路为FGF2调节奶牛乳腺分支形态发生主要信号通路。