水稻不同基因型耐盐相关性状主成分分析及综合评价

邹德堂，郭 微，孙 健，王敬国，刘化龙，郑洪亮，赵宏伟，谢冬微

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030;2.黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨 150086）

水稻（Oryza sativa L.）产量及生长发育受盐渍土危害严重[1]。据统计，土壤盐渍化已覆盖全球约20%灌溉土地，导致水稻无法正常生长，降低产量[2]。改良盐渍土质成本高、周期长、效率低。

国内外学者对水稻种质资源耐盐性鉴定开展研究，已筛选出反映水稻盐胁迫形态和生理指标。王奉斌等利用40份新疆水稻种质资源鉴定芽期耐盐性，研究表明发芽率、芽长、根长、根数可作为水稻芽期耐盐性鉴定指标，鉴定芽期极端耐盐品种6份[3]。Tian等以籼稻与普通野生稻杂交得到87个ILS群体为试验材料，表明相对根干重、相对干重和相对总干重等性状可作为水稻苗期耐盐性鉴定指标[4]。Ahmadi等研究发现，盐胁迫条件下钾离子含量变化由钠离子竞争引起，根和茎Na+、K+含量可作为水稻耐盐性鉴定指标[5]。Wang等利用1个重组自交系群体以水稻种子发芽率、发芽指数、根长、苗长和活力指数评价水稻芽期耐盐性[6]。水稻耐盐性指标筛选多局限于芽期和苗期，生长早期鉴定无法完全代表后期生长阶段耐盐能力。前人研究常以单一性状作为耐盐性鉴定指标，Xie等研究认为水稻耐盐性是受少数主效基因和多个微效基因控制的复杂性状，利用单一指标鉴定水稻耐盐性受环境影响较大[7]。水稻品种间存在较大耐盐性差异，同一品种不同生长发育阶段耐盐性不同[8]。因此，水稻耐盐性指标筛选需综合考虑各生育时期相关生理指标及农艺性状变化[9]。

主成分分析（Principal component analysis，PCA）是数据分析和模型建立方法，以少数特征量分析多元统计分布，避免因多项指标间存在相关性导致信息重叠[10]。该方法已逐渐应用于作物多指标耐盐性综合评价。戴海芳等利用主成分分析法将盐胁迫处理下棉花幼苗叶片11个单项指标转化为6个代表性综合指标，利用逐步回归分析建立棉花幼苗耐盐性数学评价模型[11]。朱春燕等在萌发期、幼苗期和果实成熟期盐胁迫处理36个甜瓜品种，运用主成分分析及聚类分析方法筛选耐盐品种[12]。熊洁等采用多元统计学方法，确定株高、根长、叶中可溶性糖含量、叶中脯氨酸含量4项指标对油菜耐铝性鉴定有显著影响[13]。彭智等筛选适宜小麦芽期和苗期耐盐性鉴定NaCl浓度，利用主成分分析和聚类分析综合评价小麦芽期和苗期耐盐性，筛选耐盐种质[14]。Shelke等利用主成分分析将10个大豆基因型划分为三类，研究种子萌发和幼苗早期生理生化指标，结果表明根和茎K+/Na+浓度比值是大豆耐盐性鉴定关键指标[15]。

本研究在强耐盐性粳稻品种长白10号与盐敏感粳稻品种东农425杂交衍生的RIL群体中挑选60份生育期一致株系为试验材料，利用相关分析、主成分分析及聚类分析，综合评价水稻耐盐性相关性状，探究水稻耐盐生理指标及农艺性状间相关关系，初步鉴定盐胁迫下水稻各基因型耐盐能力，旨在为水稻耐盐资源筛选与鉴定提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在盐敏感粳稻品种东农425（DN425）和强耐盐性粳稻品种长白10号（CB10）杂交获得的F8、F9RIL群体中，挑选出60份生育期一致家系为试验材料。其中东农425为东北农业大学水稻研究所选育，黑龙江省广泛种植粳稻品种，长白10号为吉林省农业科学院水稻研究所提供粳稻品种。

1.2 试验设计

田间试验在东北农业大学阿城实验实习基地开展。分别于2016年、2017年4月中旬播种，旱育秧苗，5月中旬移栽至大田。采用随机区组排列，4行区，行长2m，行距30cm，穴距10 cm，3次重复。

将试验材料分别移栽至盐池和对照池中，水稻返青后开始盐胁迫处理，采用浓度为6 ds·m-1NaCl水溶液（相当于0.36%）灌溉[16]，对照池正常水灌溉，为确保盐处理强度稳定，浓度不波动，需每天分别在早、中、晚监测盐池内NaCl浓度，若遇降雨或高温天气应及时排水，重新灌溉。水肥利用、病虫害防治及除草管理等综合措施与常规大田一致。

1.3 测定指标与方法

在水稻开花期测定以下各项指标：利用M410型火焰光度计分别测定盐胁迫及对照处理下茎部Na+、K+浓度（The stem Na+concentrations，SNC；the stem K+concentrations，SKC）及叶部 Na+、K+浓度（The leaf Na+concentrations，LNC；the leaf K+concentrations，LKC）[17]；利用便携式光合仪CI-340（CID，Camas，WA，USA）测定盐胁迫及对照条件下水稻主茎剑叶蒸腾速率（Transpiration rate，TR）、气孔导度（Stomatal conductance，SC）[18]，利用德国生产TFI-500型红外测温仪测定水稻冠层温度（Canopy temperature，CT）[19]；利用LiCor-3100叶面积测定仪（LiCor，Lincoln，Nebraska，USA）测定水稻主茎剑叶自然卷曲宽度（Leaf natural curling，Ln）、叶片展开后宽度（Leaf width，Lw）及叶片长度（Leaf length，Ll）[20]，利用如下公式计算叶片卷曲度和叶面积：叶面积（LAR）=Ll×Lw×0.75；叶片卷曲度（LRI）=（Lw-Ln）/Lw×100%。

水稻完熟期测定4项产量相关性状，包括穗长（Panicle length，PL）、单株有效穗数（Panicle number per plant，PN）、千粒重（Thousand grain weight，GW）和单株穗重（Panicle weight per plant，PW）[16]。

1.4 数据处理与统计分析

1.4.1 水稻耐盐系数（Salt tolerant coefficients，STC）

以各耐盐性状相对值（耐盐系数）作为试验指标，可降低因植株生长发育差异产生的影响，结果较为客观[21]。

1.4.2 各基因型综合指标隶属函数值Xj表示第j个综合指标；Xmin表示第j个综合指标最小值；Xmax表示第j个综合指标最大值。

1.4.3 各基因型综合指标权重

wj表示第j个综合指标在所有综合指标中重要程度即权重；Pj为各基因型第j个综合指标贡献率。

1.4.4 各基因型耐盐性综合评价值

D值为各基因型在盐胁迫条件下由综合指标评价所得耐盐性综合评价值。

结合两年数据平均值，利用Excel 2013分析数据平均值、标准差及变异系数。利用各主成分对应贡献率求得权重[22]。结合隶属函数值及相应权重计算综合评价值。利用SPSS19.0软件作相关性、主成分及聚类分析[8,23]。聚类分析采用欧式距离离差平方和法。

2 结果与分析

2.1 不同基因型性状间变异

根据60份材料在盐胁迫处理及对照条件下结果，分别计算各指标STC与性状间平均值及变异系数。由表1可知，盐胁迫条件下，60份试验材料，除冠层温度、叶面卷曲度、茎叶Na+、K+浓度外，其他各指标平均值均低于对照组。相比于对照组，盐胁迫处理下多项指标间，茎Na+耐盐系数平均值最高，叶Na+其次。表明在盐胁迫下水稻各器官和组织积累大量Na+，造成水稻体内离子毒害，降低地上部生物量合成，抑制水稻正常生长。

从变异系数来看，15个性状指标在盐胁迫条件下存在不同程度变化。其中茎叶Na+、K+变异系数普遍高于其他性状，均在51%以上。改良潜力较大，易受环境影响。冠层温度变异系数最小，说明该性状改良潜力有限，受其内在因素影响较大。盐胁迫对水稻不同生育时期影响因其基因型及处理条件不同存在差异，仅利用单一指标耐盐系数分析评价水稻耐盐性不具有代表性。

2.2 不同基因型各性状间简单相关分析

盐胁迫下水稻形态及生理机制存在差异，利用各指标间相关性分析可揭示不同指标间密切程度。由60份试验材料15个性状相关关系可知（见表2），盐胁迫下叶面卷曲度与叶长呈极显著正相关（r=0.816）。水稻叶片是源-库关系形成场所，叶长增加使叶片卷曲度升高，光合作用受限，降低水稻地上部吸收营养物质能力。同时单株有效穗数与穗重呈极显著正相关（r=0.902），说明有效穗数是产量构成因素之一，可有效提高水稻产量，是高产品种资源鉴定重要性状。由于各指标间存在一定联系且相关程度不一致，出现信息重叠，影响耐盐性鉴定效果。水稻对盐胁迫表现为中度敏感，品种间存在耐盐性差异，同一品种不同生育时期各指标在盐胁迫下作用不同。

2.3 主成分分析

利用SPSS19.0软件分别对60份水稻材料15个性状耐盐系数作主成分分析（见表3）。盐胁迫处理下，前7个综合指标累计贡献率达74.086%。表明在盐胁迫下7个主成分可较好反映最初15个单项指标所涵盖大部分内容，可通过7个主成分概括60份供试材料耐盐性间相关关系。

表1 不同基因型耐盐相关性状表型变异Table 1 Phenotypic variation of salt tolerancerelated traits in different genotypes

由表3可知，盐胁迫处理下，决定第一主成分性状主要包括叶长、单株有效穗数和单株穗重，水稻剑叶生长状态直接影响生物量积累，影响产量形成，同时单株有效穗数及穗重是产量构成因素之一，因此该成分可概括为产量因子；决定第二主成分性状主要为叶长、叶宽、叶面积，可概括为剑叶形态因子；决定第三、四主成分性状主要为茎Na+、茎K+及叶Na+，可概括为细胞膜稳定性因子；决定第五、六、七主成分性状主要是叶片卷曲度、蒸腾速率及气孔导度等，可概括为光合因子。

2.4 综合评价

根据公式（2）得到60个基因型盐胁迫下各主成分隶属函数值。结合7个主成分贡献率，利用公式（3）计算各主成分权重，分别为0.2173、0.2029、0.1355、0.1271、0.1238、0.0982 和 0.0953。利用公式（4）对各综合指标隶属函数值及相应权重线性加权，求出综合评价D值。

根据综合评价D值判断耐盐性（见表4），各基因型盐胁迫耐受力随D值增大而增强。

由表4可知，排名前五位基因型分别为K169、K122、 K82、 K4、 K117， 其 中 K169 D 值 最 大（0.7579），表明其在所有供试材料中综合耐盐能力最强，其次为K122（0.6157）。K46和K104排名靠后，D值较小（0.4280、0.4187），表明其耐盐能力相对于其他基因型较弱，其中K104盐胁迫耐受力最弱。

表2 不同基因型耐盐性状相关系数矩阵Table 2 Correlation coefficient matrix of salt tolerance traits of different genotypes

表3 各主成分特征向量及贡献率Table3 Eigenvector and contribution rate of the principal components

表4 各基因型综合指标D值及综合评价Table 4 D values and comprehensive valuation of different genotypes

2.5 聚类分析

依据主成分分析及综合评价结果，以D值为依据，采用欧氏距离离差平方和法对60份水稻基因型划分类群，共分为3类（见图1）。

第Ⅰ类为由8个高度耐盐基因型（K52、K64、K66、K84、K102、K114、K122、K139）及5个中度耐盐基因型（K49、K87、K108、K116、K168）组成混合类群，其中高度耐盐基因型占61.54%，比例较大，定义第一类为高度耐盐型。第Ⅱ类为中度耐盐型，包括 K9、K16、K31、K32、K37、K39、K51、K58、K82、K90、K96、K110、K121、K169，14个基因型共占第二类群基因型总数的66.67%。第Ⅲ类为盐敏感型，包括K5、K18、K25、K38、K46、K50、K61、K65、K69、K74、K92、K94、K104、K111、K128、K133、K151、K179，18个基因型占第三类群基因型总数的69.23%，其余为中度耐盐型。

图1 60份基因型不同生育时期耐盐性聚类分析Fig.1 Cluster analysesof salt toleranceof 60 genotypes during different growth stage

3 讨论与结论

3.1 水稻耐盐指标筛选

水稻耐盐基因型筛选及鉴定是培育耐盐水稻新品种核心任务，筛选简单、有效鉴定指标是耐盐水稻育种主要目标之一。通过鉴定与评价水稻种质资源耐盐性，已从中筛选一系列耐盐品种及多项与水稻各生育时期耐盐性相关农艺性状及生理生化指标。Ohsumi等研究结果显示，气孔导度[18]、冠层温度[19]、剑叶形态[20]、蒸腾速率[19,24]、株高、分蘖和单茎绿叶数抑制率[25]、单株分蘖数、穗长及结实率[16,26]、Na+、K+浓度及 Na+/K+[17,24]等均可作为水稻各生育阶段耐盐性鉴定指标。Chunthabure等研究包括4个白米和8个黑糯米水稻品种苗期耐盐性，结果表明，水稻体内积累钠离子同时可置换钙和钾等营养物质，破坏植物体内养分平衡，引起水稻生长迟缓、发育不良等现象，严重时植物死亡[27]。利用Na+、K+浓度鉴定水稻耐盐性具有重要意义。Bot等研究指出，盐胁迫下水稻单株有效分蘖数减少，无效分蘖与有效分蘖争夺养分、水分和阳光，造成极大浪费，且成熟期随盐浓度升高，生育期天数延长，结实率和单株穗重均呈下降趋势，降低产量[28]。水稻单株分蘖力和成熟期结实率、单株穗重存在明显基因型差异，因此单株有效分蘖数、结实率及单株穗重可作为评价水稻耐盐强弱重要指标。程广有等研究表明，水稻不同基因型间耐盐性强弱存在较大差异，同一基因型不同生育时期、不同性状间对盐胁迫反应机制不同[25]。其中，水稻在幼苗期和扬花期对盐分较敏感，而芽期、分蘖期和成熟期相对具有较高耐盐性[29]。由于同一作物不同生育期耐盐能力不同，生育早期表现无法全面评价水稻耐盐性。本研究针对水稻开花期盐胁迫处理，整合15个农艺性状及生理指标数据系统分析水稻耐盐性，符合实际育种需求。

3.2 水稻耐盐性多元统计学分析

水稻耐盐性是受多种因子综合影响的复杂性状[30]，易受外界环境条件及自身基因型差异影响，利用单一指标难以准确评价水稻耐盐性强弱，鉴定结果不可靠。利用科学统计学分析方法可将多项耐盐相关指标数量化，与耐盐性强弱建立数量关系，高效鉴定作物耐盐性[31]。多元统计学分析方法主要有相关分析、因子分析、主成分分析、聚类分析、对应分析、多元方差分析等[32]。其中，主成分分析可将原始数据正交化线性变换到新坐标系统，数据投影落到不同坐标轴。方差最大的称为第一主成分，其次称为第二主成分，依次类推，使数据点在特定向量上投影方差最大[32]。通过线性变换将多个耐盐相关指标转化为少数综合指标，即几个互不相关主成分。本研究利用主成分分析综合评价水稻开花期及完熟期15个耐盐指标，已将15个单项指标转化为7个代表性主成分，在此基础上，结合各主成分隶属函数值及相应权重线性加权，确定各基因型耐盐性综合评价D值，比较各基因型间耐盐性差异，利用聚类分析验证。运用多元统计学分析方法，可避免单一指标评价水稻耐盐性片面性及各指标间存在不同程度相关性导致的信息重叠。近年来，该方法已广泛应用于水稻[27]、小麦[14]、棉花[11]、大豆[15]、高粱[33]等作物耐盐种质资源鉴定和筛选。

3.3 水稻耐盐基因型鉴定

盐胁迫下产量是水稻耐盐性综合反映，高产、稳产也是培育和筛选耐盐品种最终目的[34]，产量性状作为水稻耐盐性鉴定指标具有权威性。在鉴定育种材料耐盐性过程中，评价农艺性状根据盐胁迫下单株产量、结实率、千粒重、有效穗数、穗粒数、主穗颖花数等。周政利用4个聚合群体选择后代鉴定耐盐性，表明在耐盐材料筛选过程中，每穗实粒数和有效穗数选择对确保耐盐性材料产量有重要作用[34]。周根友等研究发现盐胁迫减少每穗实粒数，千粒重下降，降低水稻产量，孕穗期和灌浆结实期对水稻产量影响至关重要，可在此时期采取一定措施降低盐胁迫危害[35]。李红宇等研究表明，在混合盐碱胁迫下，产量下降与穗数和穗重均有关，其中穗重下降是主要原因[36]。本研究通过穗长、单株有效穗数、千粒重、单株穗重等多项性状综合评价及聚类分析，得到高度耐盐基因型7个，分别为K122、K139、K114、K102、K66、K84、K64，且盐胁迫下7个基因型单株穗重与千粒重均高于母本东农425，同时K139、K66、K84单株穗重与千粒重均高于父本长白10号，两性状平均值均介于两亲本之间，存在明显超亲分离现象，可作为水稻耐盐育种优良杂交亲本，与梁银培等[16]研究结果一致。曾博虹等同样认为，千粒重存在超亲遗传现象，原因是粒长、粒宽和粒厚性状基因累加结果[37]。另外，依据综合评价结果，K169、K82 D值明显高于其他基因型，但其产量与千粒重相对偏低，原因可能是不同杂交组合后代受制于不同加性和非加性效应及环境条件影响，作物营养生长与籽粒生长随盐分增高的下降现象在同一杂交组合后代中存在差异。