影响泡菜发酵过程中SOD酶活性的因素研究

罗潇，吕嘉栃，于鑫

(陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021)

泡菜作为微生物发酵蔬菜制品，含有丰富的益生菌，具有“新鲜、清香、嫩脆、味美”的特点[1,2]，并且解腻开胃，促消化，增食欲[3]，是一种健康食品，受到人们的欢迎。国内外研究表明，植物经过多种微生物发酵后能改善其风味及营养价值，并且含有丰富的酶类、维生素C、β-胡萝卜素，产生能够清除ABTS、DPPH自由基，具有还原力的物质，有一定的抗氧化能力[4-10]。人工接种微生物发酵蔬菜的抗氧化活性表现出浓度依赖性，随着添加物料的量和品种的增加而增高[11]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)作为其中主要的功效酶之一，在抗衰老、预防和治疗心脑血管等疾病方面具有明显效果[12]，但目前对泡菜中SOD酶活性的研究较少。

本研究从底物浓度、温度、pH、金属离子4个方面研究SOD酶的性质，并通过最大波长的扫描、改变邻苯三酚溶液浓度、改变样液添加量确定了国标方法检测SOD酶活性的最佳条件，最后研究了不同条件下发酵过程中SOD酶活性的变化，为制备出具有高SOD酶活的泡菜提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白菜、山药、西红柿、冬瓜、胡萝卜、油麦菜、芹菜、黄瓜：陕西西安华润万家超市；保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumparlactis)：陕西科技大学微生物实验室；焦性没食子酸(分析纯)、乙二胺四乙酸二钠(分析纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司；SOD酶(色谱纯)：上海源叶生物科技有限公司；酚酞(分析纯)：西安化学试剂采购站；氢氧化钠(分析纯)：天津市天力化学试剂有限公司；盐酸标准溶液(分析纯)：深圳市碳拓科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DM750型LEICA数码显微镜 北京瑞科中仪科技有限公司；PHS-3C型pH计 北京赛多利斯天平有限公司；QSX-280B手提式压力蒸汽灭菌锅 上海申电医疗器械厂；JY-502型电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；YC-26L型医用冷藏冰箱 中科美菱低温科技有限公司；SW-DJ-1D型单人超净工作台 苏州净化仪器有限公司；HC-3018R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；HWS-150型恒温恒湿培养箱 北京中兴伟业仪器有限公司；UV-2600型紫外分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 SOD酶性质研究

1.3.1.1 底物浓度对SOD酶活性的影响

将底物邻苯三酚的浓度分别配制成2.5，3.0，3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5，8.0 mmol/L。按照国标GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定》[13]的方法测得邻苯三酚氧化速率，得到米氏方程曲线。并取双倒数作图，计算出此条件下SOD的Km值，分析底物浓度对SOD酶活性的影响。

1.3.1.2 温度对SOD酶活性的影响

取SOD酶标品3 mg，用100 mL蒸馏水稀释，配制成待测酶液。取1 mL酶液和反应底物分别在20，25，37，42 ℃保温，每隔10 min用邻苯三酚氧化法测定SOD酶活性。

1.3.1.3 pH值对SOD酶活性的影响

取pH值分别为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，7.0，8.0缓冲液加入酶液，37 ℃水浴锅保温2 h，用邻苯三酚氧化法测定SOD酶活性。

1.3.1.4 金属离子对SOD酶活性的影响

在SOD标准品中分别加入CuSO4、ZnSO4、FeSO4和MnSO4溶液，使得酶液中金属离子的最终浓度梯度为0.01,0.03,0.05,0.1,0.3,0.5,1.0 mmol/L，充分混匀后静置1 h，用邻苯三酚氧化法测定SOD酶活性。

1.3.2 SOD酶检测方法的研究

1.3.2.1 邻苯三酚自氧化最大波长的选择

按照国标配制4.5 mmol/L的邻苯三酚溶液，对邻苯三酚自氧化过程依次隔5,10,15,20,25,30 min进行光谱扫描，扫描波长范围为250～600 nm。

1.3.2.2 邻苯三酚自氧化最佳浓度的确定

保证其他条件不变，分别配制1.0,2.5,3.0,4.5,7.0,8.5,10 mmol/L的邻苯三酚溶液，测定自氧化速率。

1.3.2.3 最佳样液添加量的选择

保证其他条件不变，将样液添加量分别设为10,20,50,100,150，200 μL，测定样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率。

1.3.3 泡菜工艺流程

盐水

↓

7种蔬菜→清洗、切分→晾干→装坛→发酵→成品。

↑

菌种

1.3.4 操作要点[14]

蔬菜：挑选色泽正常、成熟度高、无霉变、无虫蛀、无损伤的新鲜原料。

清洗、切分：将原料清洗干净、切分成长、宽、高为8 cm×1.5 cm×1.5 cm的长方体。

晾干：切好的蔬菜沥去水分，于阴凉处晾干。

菌种：将菌粉以1%的接种量接种到已灭菌的装有MRS液体培养基的厌氧管中，37 ℃培养48 h，镜检无杂菌后转接到下一批MRS培养基中。活化至3代作为接种菌液备用[15]。

发酵：将活化后的益生菌接入泡菜坛，在试验设定的接种量和温度条件下发酵7天。

1.3.5 泡菜发酵过程中影响SOD酶活性的研究[16]

1.3.5.1 接种量的影响

确定温度为25 ℃，装料量为70%，自然pH下，分别按装料量的5%,10%,15%,20%,30%体积接入等比例混合的5种菌进行发酵，分别于1，2，3，4，5，6，7天进行取样，并测定SOD酶活性。

1.3.5.2 装料量的影响

确定温度为25 ℃，接种量为装料量的20%，自然pH下，装料量分别设定为50%,60%,70%,80%发酵混合蔬菜，分别于1,2,3,4,5,6，7天进行取样，并测定SOD酶活性。

2 结果与分析

2.1 SOD酶性质研究

2.1.1 底物浓度对SOD酶活性的影响

为了研究底物浓度对SOD酶活性的影响，将底物邻苯三酚的浓度分别配制成2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5，8.0 mmol/L。按照国标的方法测得邻苯三酚自氧化的速率，得到米氏方程曲线，结果见图1。

图1 底物浓度对酶反应速率的影响Fig.1 Effect of substrate concentration on enzyme reaction rate

由图1可知，当邻苯三酚浓度很小时，SOD未被底物饱和，这时的反应速率取决于邻苯三酚的浓度，随着邻苯三酚浓度的增大，中间复合产物生成液越多，所以反应速率随之增高，当邻苯三酚浓度相当高时，溶液中的SOD完全被底物饱和，没有多余的酶，所以酶反应速率趋于稳定。将米氏方程横纵坐标取倒数，即Linewwaver-Burk双倒数作图法，得到SOD酶的Km值为3.57×10-3mol/L，即当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度为3.57 mmol/L。

2.1.2 温度对SOD酶活性的影响

为了研究温度对SOD酶活性的影响，将底物和酶液分别在20，25，37，42 ℃保温，每隔10 min分别用邻苯三酚氧化法和黄嘌呤氧化酶法测定SOD酶活性，结果见图2。

图2 不同温度下SOD酶活性Fig.2 SOD activity at different temperatures

由图2可知，SOD酶活性随温度变化显著，随着保温时间的增长，在不同温度下SOD酶活性呈波动性变化。保温75 min、20 ℃条件下，SOD活力与初始值相比下降19%左右，达到184.19 U/mL；25 ℃条件下，SOD活力为150 U/mL，与初始值相比基本没变；37 ℃条件下SOD活力为136.76 U/mL，与初始值相比有显著增长趋势，增大了88.23 U/mL；42 ℃条件下SOD活力为93.75 U/mL，与初始值相比下降了46%。综上所述，得知温度为37 ℃时SOD活力显著增大，25 ℃时SOD活力相对稳定，保持不变。

2.1.3 pH值对SOD酶活性的影响

为了研究pH值对SOD酶活性的影响，取pH值分别为2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0，8.0缓冲液加入酶液，2 h后用邻苯三酚氧化法和黄嘌呤氧化酶法测定SOD酶活性，结果见图3。

图3 不同pH值下SOD酶活性Fig.3 Determination of SOD activity at different pH values

由图3可知，pH值对SOD酶活性影响显著，随着pH值的增大，SOD酶活性呈现先上升后下降的趋势，可知pH值过低或者过高都会抑制SOD酶活性，当pH为5.0时SOD酶活性达到最大,为131.11 U/mL，pH值保持在4.0～6.0所测得的SOD酶活性相对稳定。

2.1.4 金属离子对SOD酶活性的影响

为了研究金属离子对SOD酶活性的影响，在SOD酶液中分别加入CuSO4、ZnSO4、FeSO4和MnSO4溶液，使得酶液中金属离子的最终浓度梯度为0.01,0.03,0.05,0.1,0.3,0.5,1.0 mmol/L，充分混匀后静置1 h，用邻苯三酚氧化法和黄嘌呤氧化酶法测定SOD酶活性，结果见图4。

图4 不同金属离子浓度下SOD酶活性Fig.4 Determination of SOD activity atdifferent content of metal ions

由图4可知，金属离子浓度对SOD酶活性影响不同，不同浓度的Zn2+、Cu2+和Mn2+对SOD酶活性影响较小，SOD酶活性基本保持不变，但是Fe2+对SOD有明显的抑制作用，随着Fe2+浓度不断增大，SOD酶活性逐渐降低，当浓度大于0.5 mmol/L时SOD全部失活。

2.2 SOD酶检测方法的研究

2.2.1 邻苯三酚自氧化最大波长的选择

邻苯三酚自氧化产物在特定波长处有灵敏吸收峰，但在具体应用中，测定波长的选择存在较大争议，主要是选择最大吸收峰是420 nm还是325 nm，为了准确测定其最大吸收峰位置，本试验配制4.5 mmol/L的邻苯三酚溶液，对邻苯三酚自氧化过程依次隔5,10,15,20,25,30 min进行光谱扫描，扫描波长范围为250～600 nm，其结果见图5。

图5 邻苯三酚自氧化产物在不同时间扫描的吸收光谱Fig.5 Absorption spectra of pyrogallol autoxidation products scanned at different time

由图5可知，在反应一开始时即在320 nm处出现了最大吸收峰，420 nm处基本无吸收峰出现。随自氧化反应的不断进行，反应中间产物不断积累，320 nm处峰的吸收强度不断增加。而420 nm处一直没有观测到有峰出现。文献报道的最大吸收峰为420 nm和325 nm并不准确。考虑到峰的灵敏性和准确性问题，本试验均选择在波长为320 nm处进行测定。

2.2.2 邻苯三酚自氧化最佳浓度的确定

邻苯三酚浓度可对其自氧化产物的浓度产生影响，从而影响吸收信号的强度，因此，固定其他条件不变，仅改变邻苯三酚的浓度，测定其对自氧化速率的影响，结果见图6。

图6 不同浓度邻苯三酚自氧化速率Fig.6 Different concentration of pyrogallol autoxidation rate

由图6可知，随着邻苯三酚浓度的增大，自氧化速率也随着增大，两者呈线性关系，线性方程为△A/min-1=0.015c-0.0015(R2=0.999)。结果说明在邻苯三酚浓度为4.5 mmol/L时，邻苯三酚自氧化的曲线斜率约为0.06～0.07，基本满足国标要求，因此在后面试验中均选用邻苯三酚的浓度为4.5 mmol/L。

2.2.3 最佳样品添加量的选择

用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性时，不同的样品添加量对邻苯三酚自氧化的抑制率不同，间接影响了所得到的SOD酶活性，因此固定其他条件不变，仅改变样品加样量，测定其对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，结果见图7。

图7 不同样液添加量对邻苯三酚自氧化的抑制率Fig.7 Inhibition rate of pyrogallol autoxidation with different sample additive amount

由图7可知，不同的样品添加量对邻苯三酚自氧化的抑制率不同，随着样品添加量的增加，抑制率也在增加，但是当样品添加量为100 μL时，邻苯三酚自氧化抑制率为89%；再继续增加样品添加量为150 μL，邻苯三酚自氧化抑制率增加缓慢，为94%；当样品添加量增加到200 μL时，抑制率为97%。说明反应体系中加入的邻苯三酚含量是固定的，通过不断地增加样品添加量可以有效地抑制邻苯三酚自氧化，但并不是样品添加量越多越好。

2.3 接种量及装料量对泡菜发酵中SOD酶活性的影响

通过改变接种量，在发酵7天的周期内检测SOD酶活性的变化，结果见图8。

图8 接种量对泡菜发酵过程中SOD酶活性的影响Fig.8 Effect of inoculum size on SOD enzyme activity during the fermentation of pickle

由图8可知，不同的接种量发酵均可以产生SOD酶，SOD酶活性的变化不稳定，整体随发酵时间的增长呈先增长后下降的趋势。在25 ℃下不同的接种量之间SOD酶的活性差异显著，其中接种量为20%在发酵第5天达到最大值95.75 U/mL，其次是接种量为30%的在发酵第5天时SOD酶活性为84.25 U/mL，其次是接种量为15%的在发酵第5天达到71.92 U/mL。直到发酵第7天结束时SOD酶降低到0～26.35 U/mL之间，基本与初始值相当。

2.4 装料量对SOD酶活性的影响

通过改变装样量，在发酵7天的周期内检测SOD酶活性的变化，结果见图9。

图9 装料量对泡菜发酵过程中SOD酶活性的影响Fig.9 Effect of loading quantity on SOD enzyme activity during the fermentation of pickle

由图9可知，不同的样品装样量随发酵时间的增长呈先增长后下降的趋势。其中装样量为50%与80%的发酵液中SOD酶活性较低；装样量为60%的发酵液中SOD酶活性在发酵第5天达到最大值101.52 U/mL，发酵后期有所降低；其次是装样量为70%的发酵液在发酵第4天SOD酶活性达到88.95 U/mL，后期下降明显。

3 结论

本研究从底物浓度、温度、pH、金属离子4个方面研究了SOD酶的性质，并通过邻苯三酚自氧化最大波长的扫描、改变邻苯三酚溶液浓度、改变样液添加量确定了国标方法检测SOD酶活性的最佳条件，最后研究了接种发酵泡菜中接种量与装料量对SOD酶活性的影响。结果表明：温度为25℃、pH在4.0～6.0之间时SOD酶活性较高且稳定，Fe2+浓度过高时，SOD酶活性较低甚至失活；邻苯三酚自氧化法检测SOD酶活性的最佳条件为波长320 nm、邻苯三酚浓度4.5 mmol/L；接种量为20%、装料量为70%时接种发酵泡菜中SOD酶活性较高。本研究为制备出具有高SOD酶活的泡菜提供了理论依据。