针刺对甲基苯丙胺暴露雌性大鼠生殖发育的影响

李明哲,徐平,陈永生,韩清,徐鸣曙,张英杰,单春雷



针刺对甲基苯丙胺暴露雌性大鼠生殖发育的影响

李明哲1,2,徐平2,陈永生3,韩清4,徐鸣曙1,张英杰1,单春雷2

(1.上海市针灸经络研究所,上海 200030;2.上海中医药大学,上海 201203;3.上海市公安局物证鉴定中心,上海 200439;4.复旦大学附属金山医院,上海 201508)

建立甲基苯丙胺(MA)染毒雌性大鼠模型,动态观察针刺干预对不同发育期雌性大鼠生殖发育的影响。60只雌性SD大鼠随机分为7周龄针刺组(7WA组)、7周龄不治疗组(7W组)、9周龄针刺组(9WA组)、9周龄不治疗组(9W组)和正常对照组(N组),每组12只。以2.5 mg/kg的MA制备MA染毒大鼠模型。观察肛殖距,卵巢、子宫重量和系数,血清激素水平变化。7W组与N组、7WA组比较,肛殖距明显缩短,差异有统计学意义(＜0.01)。7W组血清LH水平与N组、7WA组比较,9W组与7WA组比较,差异有统计学意义(＜0.05)。7W组血清FSH水平与N组、7WA组、9WA组及9W组比较,9W组与N组、7W组比较,差异有统计学意义(＜0.05)。针刺干预可增加雌性MA染毒大鼠的肛殖距;提高其血清FSH、LH水平,可能对雌性大鼠MA暴露所致生殖发育功能有促进作用。

针刺疗法;电针;甲基苯丙胺;肛殖距;卵泡刺激素;黄体生成素;物质相关紊乱;大鼠

甲基苯丙胺(methamphetamine, MA),俗称冰毒,属于苯丙胺类兴奋剂(amphetamine type stimulus, ATS)的一种,是目前全球滥用最为猖獗的毒品之一,严重危害社会的健康发展。MA具有强大的神经兴奋作用,可以导致心瘾,控制和认知能力降低,还能引起月经紊乱、停经,性功能减退,导致生殖内分泌功能紊乱,妇科疾病发病率增高等,严重危害女性的生殖健康,甚至累及其子代。

女性对苯丙胺较男性有更强的易感性,并且滥用呈低龄化趋势。相对男性,成瘾女性处于不同月经周期对可卡因或苯丙胺产生不同的主观效应[1],表现为经量减少,甚至闭经,其紊乱程度与吸毒、多药滥用的持续时间及药量成正相关[2];吸毒对女性月经周期的影响是可逆的,但月经复来后经量增多及痛经发生的例数增多[3]。滥用甲基苯丙胺后55%的依赖者出现月经改变,其中37%出现明显月经紊乱。激素紊乱类型与患者年龄、滥用时间及强戒隔离时间等存在明确联系[4]。此外,如果整个孕期持续滥用,其子代所有的发育阶段都会有明显的延迟[5],尤其是当剂量达到2.5 mg/kg时,其子代中雄性的生殖器的距离会显著缩短,无论雌性还是雄性的毛发出现和睁眼时间都会明显缩短[6]。

目前,国内外对MA滥用的治疗方法很少,尚无批准的治疗药物[7]。本课题组曾关注其影响学习、记忆及睡眠,采取针刺治疗,疗效显著[8-9]。而对其导致生殖及内分泌紊乱的治疗,尚无文献报道。故本文用针刺干预治疗MA依赖所致大鼠生殖及内分泌系统紊乱,以期为今后的临床研究提供一定的依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

6周龄状态良好、发育正常的健康清洁级SD大鼠60只,雌性,体重150～170 g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物房,许可证号为SYXK(沪)2013 -0109。饲养环境为昼夜12 h交替,室内温度25℃,湿度50%～60%,食物和水自由摄取。实验过程对大鼠的各种干预手段均按照科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。动物适应环境1周后,将所有雌性大鼠采用随机数字表进行随机分组。分为7周龄针刺组(7WA组)、7周龄不治疗组(7W组)、9周龄针刺组(9WA组)、9周龄不治疗组(9W组)和正常对照组(N组),每组12只。

1.2 模型制备

参照相关文献[10]制备MA染毒大鼠模型。MA由上海市公安局物证鉴定中心提供,纯度为98%,用0.9% NaCl溶解使用。给予MA染毒大鼠组腹腔注射MA (2.5 mg/kg),即按当日体重的0.25%给予。7WA组和7W组从7周龄第1天开始;9WA组和9W组从9周龄第1天开始,每日1次,连续注射7天,末次注射后30 min开始观察大鼠活动情况,并记录相关行为变化。所有染毒大鼠参照Sams-Dodd评分标准对大鼠的刻板行为进行评价[11],静止,几乎或根本没有活动为0分;正常活动,偶而有向前运动为1分;有活动伴随并反复向前探索为2分;持续向前探索为3分;反复抬头、摇头或旋转为4分;迅速摇头、旋转或带摇头的背腹运动为5分。每10 min评分1次,记录刻板行为持续时间,以刻板行为评价≥2分,持续时间≥15 min为造模成功。

1.3 治疗方法

1.3.1 N组

不进行抓取,没有注射及干预。

1.3.2 7WA组和9WA组

造模后11周龄时根据《实验针灸学》[12]取足三里、三阴交、关元,采用0.30 mm×25 mm一次性使用无菌针灸针进行针刺。关元针刺深度约0.5 cm,足三里、三阴交进针深度约0.3 cm,进针后小幅度捻转。进针得气后,双侧足三里接通G6805-Ⅱ低频电子脉冲治疗仪(上海医用电子仪器厂生产),连续脉冲波,刺激频率2 Hz,电流范围在10～30 mA之间,20 min。针刺治疗时动物处于相对自由状态,不进行麻醉,治疗者以手固定大鼠,使大鼠配合针刺,若针刺时针具脱落,则需再次针刺穴位,使针刺时间达到20 min。每周连续治疗5 d,休息2 d,共治疗10次,10次为1个疗程。

1.3.3 7W组和9W组

只建立了染毒模型,没有采用任何干预手段。

1.4 取材

为了保持各组间取材及数据的一致性,所有大鼠均在15周龄第1天时称重,模型组大鼠腹腔注射MA(2.5 mg/kg)以染毒,染毒2 h后麻醉(10%的水合氯醛,4 mL/kg),N组直接麻醉,麻醉后取大鼠股动脉血5 mL。但由于9WA组是第一批染毒并且麻醉处死的,所以注射水合氯醛麻醉时意外死亡1只大鼠,因无法取到足量的动脉血,故舍弃该只大鼠的所有数据。考虑到可能是由于MA与水合氯醛同用的联合反应,所以其他模型组采用2.5 mL/kg的剂量进行麻醉,无其他意外产生,N组大鼠仍然以4 mL/kg剂量进行麻醉。取血后分离子宫及卵巢,剔除子宫及卵巢内的多余脂肪。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠体重

对11周龄和15周龄的大鼠称重,观察各组MA染毒后体重变化。

1.5.2 肛殖距

在处死实验动物前用游标卡尺(日本三丰Mitutoyo,530-512)测量各组的肛殖距。

1.5.3 子宫、卵巢重量和系数

取材后称取子宫湿重、卵巢重量,并计算子宫、卵巢的脏器系数(脏器系数=脏器重量/体重×1000‰)。

1.5.4 血清激素检测

处死前取大鼠股动脉血5 mL,室温静置1～2 h后台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)离心,取上清液,于﹣80℃保存备用。检测前恢复至室温,采用酶联免疫吸附法检测血清LH、FSH含量,采用相关试剂盒(上海源叶生物科技有限公司),具体操作方法严格按照试剂盒说明书进行,统计数值为测试浓度×5倍。

1.6 统计学方法

应用SPSS24.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以均数±标准差表示,采用方差分析和检验,不符合正态分布采用秩和检验。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

实验期间,各组动物饮食、活动均正常,生长状况良好。每次染毒后模型组大鼠均会出现刻板行为,表现为持续向前探索;反复抬头、摇头或旋转及迅速摇头、旋转或带摇头的背腹运动。按照Sams-Dodd评分标准均＞3分,持续时间＞2 h(每次只观察到染毒后2 h)。

2.2 各组大鼠MA染毒后体重变化比较

连续染毒7 d后,大鼠各组体重均随时间延长而增长,组间差异无统计学意义(＞0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠MA染毒后体重变化比较 (±s,g)

2.3 各组大鼠治疗后肛殖距比较

7W组与N组比较,肛殖距缩短明显,差异有统计学意义(＜0.01);7W组与7WA组比较,肛殖距缩短明显,差异有统计学意义(＜0.01)。

表2 各组大鼠治疗后肛殖距比较 (±s,mm)

注:与7W组比较1)＜0.01

2.4 各组治疗后卵巢、子宫重量和系数比较

各组治疗后卵巢、子宫重量和系数比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。详见表3。

表3 各组治疗后卵巢、子宫重量和系数比较 (±s)

2.5 各组治疗后血清激素比较

7W组血清LH水平与N组、7WA组比较,差异有统计学意义(＜0.05);9W组血清LH水平与7WA组比较,差异有统计学意义(＜0.05);7W组血清FSH水平与N组、7WA组、9WA组及9W组比较,差异有统计学意义(＜0.05);9W组血清FSH水平与N组、7W组比较,差异有统计学意义(＜0.05)。详见表4。

表4 各组治疗后血清激素比较 (±s, mIU/mL)

注:与7W组比较1)＜0.05;与9W组比较2)＜0.05

3 讨论

近年来,MA滥用问题越来越严峻,女性的滥用问题也越来越突出,其滥用人群为21～35岁的年轻女性[13];60.5%的女性滥用者在年龄小于18岁时开始滥用[14]。雌性大鼠的青春期为出生后第34～38 d,所以一般针对青春期的研究往往选择6周龄的大鼠[15],为了更接近女性MA的真实滥用情况,本研究选择建立7周龄(青春期,即性成熟期)及9周龄(生育期,即体成熟期)MA染毒大鼠模型。

成瘾性药物可使女性雌激素及孕激素长期处于低水平,从而导致下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱。女性对MA的敏感性与雌激素分泌相关,雌激素水平较高时,女性对MA更敏感。女性药物滥用的后果还涉及到子女,影响围产儿预后,早产、低体重儿、新生儿的发生率也与吸毒时间密切相关[16]。研究显示,100620例产妇中有0.5%的是毒品依赖者,其中3.9%是MA依赖者[17];雌性大鼠在孕期皮下注射MA,其子代肛殖距和体长较其他组明显缩短(＜0.01)[18]。

针刺可刺激经络,调节下丘脑-垂体-性腺轴,提高血清中雌二醇(E2)、孕激素(P)、FSH、LH,改善排卵功能,从而促使紊乱的生殖及内分泌功能恢复正常[19-22]。研究显示,深刺组与浅刺组均能降低LH水平,且深刺组下降幅度较浅刺组大,与安慰针组比较,差异有统计学意义(＜0.05)[23]。针刺治疗女性内分泌紊乱历史悠久,疗效显著,如张桂芝等[24]研究发现针刺治疗126例海洛因依赖闭经的患者疗效显著,针刺的疗效与吸毒和闭经时间显著相关,闭经时间越长,疗效越差;但对吸毒时间长者,针刺疗效却很显著。吴鎏桢等[25]发现跨皮肤电刺激可促使海洛因成瘾者性机能恢复,血清性激素LH和T水平显著上升,减轻海洛因依赖者的戒断症状,调节性机能。本研究选用足三里、三阴交和关元三穴,其中足三里为足阳明胃经合穴,胃的下合穴,具有温补脾胃、益气养血、扶正培元的功效;三阴交为肝肾脾三阴经的交会穴,可调理肝脾肾三脏、理气活血、濡养胞宫;关元穴是任脉与足太阴脾经、足厥阴肝经、足少阴肾经的交会穴,任脉起于胞中,主胞胎,可培肾固本、健脾、调理冲任。三穴同用能增强补肾、健脾、调冲任作用,调整机体阴阳气血平衡,使肾-天癸-冲任-胞宫轴功能正常运行,以恢复正常的生殖发育功能。

本研究显示,雌性大鼠MA暴露对其生殖内分泌系统产生一定的影响。7W组与N组比较,肛殖距缩短明显,差异有统计学意义(＜0.01)。7W组血清LH水平与N组比较差异有统计学意义(＜0.05)。7W组血清FSH水平与N组、9W组比较,9W组与N组比较,差异有统计学意义(＜0.05)。针刺治疗对其紊乱的生殖内分泌功能有调节和改善的作用。7WA组与7W组比较,肛殖距增长明显,差异有统计学意义(＜0.01)。7WA组与7W组、9W组比较,血清LH水平明显升高,差异有统计学意义(＜0.05)。7WA组与7W组比较,血清FSH水平明显升高,差异有统计学意义(＜0.05)。

综上所述,针刺干预可增加雌性MA染毒大鼠的肛殖距;提高其血清FSH、LH水平,可能对雌性大鼠MA暴露所致生殖发育功能有促进作用。但由于本研究样本量较小,检测指标较少,不能充分阐明MA暴露对雌性大鼠生殖内分泌紊乱的作用机制及针刺的干预作用,但值得后续进一步采用大样本、多维度的相关基础研究。

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Effect of Acupuncture on the Reproductive Development in Methamphetamine-exposed Female Rats

-1,2,2,-3,4,-1,-1,-2.

1.,200030,; 2.,201203,; 3.,200439,; 4.,201508,

By establishing methamphetamine (MA)-addicted female rat model, to dynamically observe the effect of acupuncture on the reproductive development of the female rats in different developmental stages.Sixty female Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into a 7-week acupuncture group (7WAG), a 7-week non-treatment group (7WG), a 9-week acupuncture group (9WAG), a 9-week non-treatment group (9WG) and a normal control group (NG), with 12 rats in each group. The MA-addicted rat model was established by administration of MA at 2.5 mg/kg. The anogenital distance, weights of ovaries and uterus and the ratio, as well as changes in serum hormones were observed.Compared with the NG and the 7WAG, the anogenital distance in the 7WG was significantly shorter (＜0.01). In comparing the level of serum luteinizing hormone (LH), the 7WG was significantly different from the NG and the 7WAG, and the difference between the 9WG and the 7WAG was also statistically significant (＜0.05). In comparing the level of serum follicle-stimulating hormone (FSH), the 7WG was significantly different from the NG, 7WAG, 9WAG and 9WG, and the 9WG was significantly different from the NG and the 7WG (＜0.05).Acupuncture can increase the anogenital distance of MA-addicted female rats and their serum levels of FSH and LH. It may promote the reproductive development of MA-exposed female rats.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Methamphetamine; Anogenital distance; FSH; LH; Substance-related disorders; Rats

1005-0957(2018)09-1063-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.09.1063

2018-01-29

上海市卫生与计划生育委员会项目(20144y0159)

李明哲(1985—),女,助理研究员,硕士,Email:xiaoming308@163.com

徐鸣曙(1978—),男,副研究员,硕士生导师,博士,Email:mingshuxu@163.com