黄金茶多糖结构初探及除蛋白工艺研究

熊 磊，陈 慧，王 宁，刘 鑫，李祥格，吴国强，李景恩，王文君

(江西农业大学 食品科学与工程学院/南昌市农产品加工与质量控制重点实验室，江西 南昌 330045)

黄金茶是由柳叶蜡梅的嫩叶经加工制作而得到的一种绿茶。柳叶蜡梅为半常绿灌木，多生长在浙江西部和江西东北一带[1]。黄金茶含有多糖、黄酮、挥发油、生物碱类等多种有效活性成份[2]，而且富含铁、钙、锌、镁、硒等微量元素及VB1、VB2、VC等，并含有18种氨基酸[3]。黄金茶多糖是从黄金茶叶中提取出来的具有多种生物活性且结构复杂的杂多糖或其复合物[4]。大量研究报告表明，多糖具有抗氧化、免疫调节、降血脂、降血糖、抗凝血等多种功效[5,9]。由于多糖在各个领域尤其是食品方面的广泛应用，有关多糖的开发利用与研究日益活跃。

目前，国内外对黄金茶多糖的文献报道较少，而黄金茶多糖又具有较高的生物活性[10]。本试验通过紫外光谱(UV)、红外光谱(FT-IR)、气相色谱(GC)、扫描电镜(SEM)等方法对其结构进行探究；同时对分离提取得到的黄金茶粗多糖进行纯化，而除蛋白是粗多糖纯化过程中至关重要的环节。常用的除蛋白方法有Sevage法、蛋白酶水解法和酸类物质沉淀法等[11-13]。利用Sevage法对黄金茶多糖除蛋白工艺的研究还未见报道，本试验选取主要影响蛋白质脱除效果的Sevage试剂添加量、振摇时间、氯仿与正丁醇体积比进行单因素实验，在此基础上，设计L9(33)正交实验，确定最佳除蛋白工艺条件[14]。旨在为了解黄金茶多糖特性，进一步为黄金茶多糖的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄金茶叶，购于江西省玉山县，粉碎机粉碎，过60目筛，在电热恒温干燥箱中60 ℃下干燥15 h后放于干燥器中备用；分析纯葡萄糖(105 ℃干燥至恒质量)；考马斯亮蓝g-250、石油醚、无水乙醇、乙醚、丙酮、苯酚、浓硫酸、溴化钾、三氟乙酸、甲醇、硼氢化钠、冰醋酸、乙酸酐、甲苯、氯仿、无水硫酸钠、正丁醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸和三氯化铁均为分析纯。

1.2 仪器与设备

RE-5205旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；GPX-9248A干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；BS224S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；TGL-16GB台式离心机，上海安亭科学仪器厂；冷冻干燥机，宁波新芝生物科技有限公司；立式超低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司；YP-2压片机，上海山岳科学仪器有限公司； Nicolet iS5红外光谱仪，Thermo； GC7890A气相色谱仪，Agilent； SB3200DTDN超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司； TDL-5-A低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；V-5600型可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黄金茶粗多糖的分离、提取、纯化 黄金茶叶→干燥→粉碎→过60目筛→黄金茶粉末→石油醚脱脂→超声循环水提取→滤液减压浓缩→Sevage法除蛋白6次→脱色透析48 h→95%乙醇醇沉→无水乙醇洗涤→丙酮洗涤→乙醚洗涤→真空抽滤→冷冻干燥→黄金茶粗多糖→上DEAE-纤维素柱→0.3% NaCl洗脱→冷冻干燥→黄金茶多糖。

1.3.2 黄金茶多糖的纯度鉴定 采用苯酚-硫酸法[15]测定黄金茶多糖纯度，配制0.2 mg/mL的葡萄糖溶液，分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL葡萄糖溶液至试管中，加水至1 mL，分别加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5 mL浓硫酸，混匀后反应30 min，在490 nm波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据回归方程求得C，按如下公式计算黄金茶多糖的纯度：

黄金茶多糖纯度(%)=(C×f×V×100%)/(m×1000)

(1)

式中：C为提取所得黄金茶多糖浓度；f为溶液稀释倍数；V为提取液体积；m为黄金茶粉末质量。

1.3.3 黄金茶多糖的结构初探 (1)红外光谱扫描。取少量的黄金茶多糖与KBr(m黄金茶多糖∶mKBr=1∶100)粉末充分研磨后压片，使用傅里叶变换红外光谱在4 000～400 cm-1进行扫描。

(2)紫外光谱分析。将一定量的黄金茶多糖完全溶解到蒸馏水中，使用紫外-可见光分光光度计对多糖溶液在400～200 nm进行扫描。

(3)气相色谱分析黄金茶多糖的单糖组成。

黄金茶多糖(2 mg)→三氟乙酸水解(2 mol/L，1 mL，90 min)→旋转蒸发仪蒸干→加入2 mL甲醇，蒸干(2次)→加入双蒸水(2 mL)→硼氢化钠还原(60 mg，8 h)→冰醋酸中和、旋蒸→甲醇(3 mL，3次)→旋蒸至粉末→烘干(110 ℃)→乙酸酐乙酰化(1 mL，100 ℃，1 h)→冷却→甲苯(3 mL)→减压浓缩蒸干(4～5次)→用氯仿(3 mL)溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡(4次)→氯仿层用适量的无水硫酸钠干燥→定容至10 mL→GC分析。

GC-MS条件：Hp-5 (Agilent 19091J-413)色谱柱(30 m×0.25 mm×320 μm)；程序升温条件为：起始温度120 ℃，以3 ℃/min升温至250 ℃/min；保持5 min；进样口温度为250 ℃，检测器温度为250 ℃/min，氢气流量30 mL/min，空气流量400 mL/min；载气为N2，流速为1 mL/min。

(4)扫描电镜。使用双面胶将黄金茶多糖粉末固定在样品架上，然后进行喷金。使用扫描电镜(SEM)在15 kv的高电压和高真空条件下对样品放大2 000和10 000倍进行形态分析。

1.3.4 标准曲线的制备 (1)葡萄糖标准曲线的制备。采用苯酚-硫酸法标准曲线见图1。

(2)蛋白质标准曲线的制备。采用考马斯亮蓝法[16]，标准曲线见图2。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 A standard curve of glucose

图2 蛋白质标准曲线Fig.2 A standard curve of protein

1.3.5 单因素试验 (1)Sevage试剂添加量对黄金茶多糖除蛋白效果的影响。氯仿与正丁醇体积4∶1，振摇时间20 min条件下，Sevage试剂的添加量分别是多糖溶液的1/5，1/4，1/3，1/2，1倍时对黄金茶多糖除蛋白效果的影响，重复测定3次取平均值。

(2)振摇时间对黄金茶多糖除蛋白效果的影响。氯仿与正丁醇体积比4∶1，Sevage试剂与多糖溶液体积比1∶3条件下，振摇时间分别为10，15，20，25，30 min时对黄金茶多糖除蛋白效果的影响，重复测定3次取平均值。

(3)氯仿与正丁醇体积比对黄金茶多糖除蛋白效果的影响。Sevage试剂为多糖溶液的1/3倍，振摇时间20 min条件下，氯仿与正丁醇的体积比分别为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5时对黄金茶多糖除蛋白效果的影响，重复测定3次取平均值。

1.3.6 正交试验 在单因素试验基础上，对Sevage试剂添加量(A)，振摇时间(B)，氯仿与正丁醇体积比(C)3个因素进行正交试验，设计正交表L9(33)，研究上述3种因素对黄金茶多糖除蛋白效果的影响，从而确定最佳除蛋白工艺条件。每种组合重复3次，取平均值。试验因素水平设计见表1。

表1 正交试验的因素水平表

2 结果与分析

2.1 黄金茶多糖的结构分析

2.1.1 黄金茶多糖的红外、紫外光谱分析 从黄金茶多糖红外光谱(图3A)可知，3 412 cm-1处的吸收峰是-OH的伸缩振动吸收峰；2 937 cm-1处的吸收峰是C-H的伸缩振动吸收峰；1 614 cm- 1处的吸收峰是C=O (-COO-)不对称的伸缩振动吸收峰；1 423 cm-1处吸收峰-CH2的变形吸收峰；1 250 cm-1处则是S=O不对称的伸缩振动吸收峰，1 074 cm-1处的吸收峰是环上碳-氧(C-O)吸收峰；635 cm-1处的吸收峰是C-H的伸缩振动吸收峰[17-19]。

图3 黄金茶多糖的FT-IR光谱(A)和紫外光谱(B)Fig.3 FT-IR spectra of gold tea polysaccharide and UV spectra

从图3B中可以看出黄金茶多糖在260 nm处没有显示吸收，表明不存在核酸。280 nm处的弱峰归因于蛋白质的吸收。苯酚-硫酸法测定黄金茶多糖的纯度为65.4%[20]。

图4 7种单糖标准品(A)和黄金茶多糖(B)的GC图Fig.4 GC spectra(A)and gold tea polysaccharide(B) of seven standard monosaccharides

2.1.2 GC分析黄金茶多糖的单糖组成成分 图4A为7种标准品单糖的GC图，鼠李糖(Rha)、岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)出峰时间分别在15.924，16.402，16.625，17.649，27.660，28.208，28.661 min，图4B在16.009，16.688，17.706，27.71，28.254，28.709 min的出峰时间可知，黄金茶多糖单糖由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)6种单糖组成，且摩尔比为 0.069∶0.148∶0.056∶0.051∶0.566∶0.102。

2.1.3 扫描电镜图 图5A、5B分别是黄金茶多糖在2 000倍和10 000倍下的扫描电镜图像。从图中可以看出黄金茶多糖表面结构圆滑工整，且均为较规则的几何体，10 000倍下的扫描电镜图可以看到各单糖分子间有一定的空隙，说明其分子间存在一定的排斥力[21]。

图5 黄金茶多糖2 000和10 000倍下的扫描电镜图像(A,B)Fig.5 SEM image of gold tea polysaccharide under 2 000 and 10 000 times

2.2 单因素结果分析

2.2.1 Sevage试剂添加量对黄金茶多糖除蛋白效果的影响 由图6结果可以看出，随着试剂添加量的增大，黄金茶蛋白质除去率呈现出先升高后降低再升高的趋势，这可能与Sevage法除蛋白的机理有关,也可能与黄金茶多糖中蛋白质的种类及与多糖的结合方式有关[22]。试剂添加量在1/3倍时达到最大值，且与其他4组比较，差异显著(P<0.05)。多糖损失率呈现出平稳上升的趋势，且除了1倍时达到17.35%之外，其余均在10%以下。综合考虑可得：添加1/3倍体积黄金茶多糖溶液的Sevage试剂除蛋白效果较好。

2.2.2 振摇时间对黄金茶多糖除蛋白效果的影响 由图7结果可以看出，随着振摇时间的延长，黄金茶蛋白质除去率呈现出先升高后降低的趋势，这可能与黄金茶多糖中蛋白质的种类及与多糖的结合方式有关[22]。在20 min时达到最大值，且与其他4组比较，差异显著(P<0.05)。多糖损失率呈现平稳上升的趋势，除30 min时达到10.813%之外，其余均在10%以下。综合考虑可得：黄金茶多糖溶液在振摇20 min时除蛋白效果较好。

图6 Sevage试剂添加量对黄金茶多糖除蛋白效果的影响Fig.6 Effect of the sevage reagent content on deproteinization of gold tea polysaccharide

图7 振摇时间对黄金茶多糖除蛋白效果的影响Fig.7 Effect of shaking time on deproteinization of gold tea polysaccharide

图8 氯仿正丁醇体积比对黄金茶多糖除蛋白效果的影响Fig.8 Effect of volume ratio (chloroform:n-butanol) on deproteinization of gold tea polysaccharide

2.2.3 氯仿与正丁醇体积比对黄金茶多糖除蛋白效果的影响 由图8结果可知，随着氯仿正丁醇体积比的不断增大，黄金茶多糖蛋白除去率呈现出先升高后降低的趋势，这可能与黄金茶多糖中蛋白质的种类及与多糖的结合方式有关[22]。在氯仿与正丁醇体积比为4∶1时达到最大值64.31%，且与除了3∶1之外的其余3组比较，差异显著(P<0.05)。而多糖损失率从氯仿正丁醇体积比为1∶1的42.3%迅速下降至3∶1时的9.045%，其后下降幅度变得极其平缓。综合考虑可知：黄金茶多糖溶液中添加氯仿正丁醇体积比为4∶1的Sevage试剂除蛋白效果较好。

2.3 黄金茶多糖Sevage法除蛋白最佳工艺的确定

根据表2和表3的数据分析可知，3因素对黄金茶多糖Sevage法除蛋白效果均显著，且这3个因素对黄金茶多糖除蛋白效率的影响大小分别是A>C>B，即Sevage试剂添加量>氯仿正丁醇体积比>振摇时间。Sevage试剂添加量对黄金茶多糖除蛋白效果的影响极显著，是影响该试验结果的主导因子。根据K值大小和各因素各水平之间的比较，黄金茶多糖Sevage法除蛋白的最佳工艺组合为A2B2C3，即为Sevage试剂添加量为黄金茶多糖溶液的1/3，振摇时间为20 min，氯仿和正丁醇的体积比为4∶1。由表4可知，重复性试验结果表明，正交优化条件下最佳工艺条件的的重现性较好，(RSD=1.477%)，除蛋白率可达64.94%，(RSD=1.777%)，多糖含量可达90.14%。

表2 正交试验结果

本试验采用综合加权平均法[23]，权重系数均为0.5，分别把两项中最大的指标定为100分，各号按下式评分：综合评分=(脱蛋白率/60)×100×0.5 + (多糖含量/91)×100×0.5

表3 方差分析

*：P≤0.05，**：P≤0.01

2.4 重复性试验

表4 重复性试验结果

3 结 论

黄金茶粗多糖经除脂肪、色素、蛋白等杂质，过DEAE-纤维素柱，0.3% NaCl洗脱后，其纯度达到65.4%。黄金茶多糖含有部分糖蛋白，含有-OH、-CH、-COOH、S=O、-C=O等官能团。黄金茶多糖由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)6种单糖组成，且6种单糖的摩尔比为 0.069∶0.148∶0.056∶0.051∶0.566∶0.102。利用Sevage法得出黄金茶多糖最佳除蛋白工艺为：Sevage试剂添加量为多糖溶液的1/3，振摇时间20 min，氯仿正丁醇体积比4∶1，在此条件下，黄金茶多糖的除蛋白效率最高且能保证多糖的损失率在合理范围内。