基于固相微萃取技术探究花叶艳山姜的挥发性成分及变化规律

沈 鑫，陈艳敏，李永红，蒋冬月*

(1.浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；2.深圳职业技术学院，广东 深圳 518055)

花叶艳山姜(Alpiniazerumbetcv.Variegata)是姜科(Zingiberaceae)山姜属(Alpinia)艳山姜(Alpiniazerumbet)的栽培品种，为多年生常绿草本观叶植物。叶色艳丽，有金黄色的纵斑纹、斑块，富有光泽，十分迷人；花冠白色，边缘黄色，花瓣顶端红色，花姿优美，花香清纯，花期夏季，是观赏价值很高的观叶观花植物，在我国南方各省均有栽植[1-2]。花叶艳山姜不仅形态优美，而且香味独特，更重要的是其精油具有抗氧化、抗炎抑菌、镇痛以及防治心血管系统疾患等多方面的功效，在民间是祛寒暖胃、治疗消化不良和呕吐腹泻等疾病的良药[3-6]。目前对花叶艳山姜的研究主要集中在生理特性[7-8]、无性繁殖[9-10]、精油化学成分及提取技术[11,16]等方面，并未见有关花叶艳山姜花瓣挥发性有机物成分及叶片挥发性有机物成分变化规律的相关报道。现有其他物种的研究表明，随着环境、气候等条件的改变，植物释放的挥发性有机物的成分及相对含量也会随之变化[17,23]。因此，本研究采用固相微萃取技术吸附采集不同时期花叶艳山姜叶片挥发性有机成分，结合气质联用仪检测并分析花叶艳山姜不同季节及一天中不同时间释放的挥发性有机物成分及相对含量，揭示其叶片挥发性有机物的季节变化规律和日变化规律；并用相同的方法研究花叶艳山姜叶片和花瓣挥发性有机物成分的差异，为科学利用花叶艳山姜营造生态型、保健型、芳香园林景观提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用花叶艳山姜苗龄5 a，苗高90～130 cm，叶长45～55 cm，叶宽15～20 cm，长势繁茂，无病虫害，种植于深圳职业技术学院西校区芳香植物园内。

1.2 试验方法

1.2.1 植物挥发性有机物的采集和测定 分别于3月、6月、9月、12月的15日09:00—10:00在同一位置的植物上摘取向阳侧上、中、下部位的健康无损伤的叶片10片，分别剪碎混匀，称取0.5 g放置5 mL萃取瓶中密封，静置30 min，环境温度为(22±3)℃。将型号为DVB-CAR-PDMS 100 μm的SPME纤维头(美国Supelco公司)通过聚四氟乙烯瓶垫插入到萃取瓶中，置于样品正上方0.5 cm左右，顶空萃取40 min，然后将纤维头插入6890N/5975气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)的GC进样口，解吸10 min。每次收集设置三次重复，吸附空萃取瓶中的气体作为空白对照。花瓣挥发性有机物的测定于6月16日进行，09:00—10:00采摘盛开的花朵5朵；挥发性有机物日动态变化的测定于6月16日进行，08:00—20:00每2 h采样1次。

色谱条件：HP-5MS弹性石英毛细管柱色谱柱，长30 m，内径0.25 mm，液膜厚0.25 μm，载气为高纯氦气，不分流进样，恒流流速1.0 mL/min，进样口温度230 ℃，接口温度280 ℃。季节变化和花瓣挥发物测定选择初始温度50 ℃，保持4 min，以6 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，然后以7 ℃/min升至250 ℃，保持8 min。日动态变化规律测定选择初始温度50 ℃，保持4 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min升至250 ℃，保持6 min。质谱条件：电子轰击(EI)离子源，电子能量70 eV，离子阱温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，质量扫描范围30～500 m/z。

1.2.2 数据处理 挥发性有机物成分经气相色谱分离，各色谱峰、质谱峰分别利用GC-MS中MSD Productivity ChemStation和NIST Mass Spectral Database 2008谱库进行分析鉴定。各成分在样品气体中的浓度采用峰面积归一法进行计算，计算公式为：浓度=(该物质峰面积/样品所有气体峰面积之和)×100%，通过该公式计算得出的结果代表某物质在所采集的总气体样品中的相对百分含量。

2 结 果

2.1 花叶艳山姜叶片挥发性有机成分和含量的季节动态变化

通过GC/MS分析，扣除本底空气中的杂质，从花叶艳山姜叶片一年中不同季节释放的挥发性有机物中共鉴定出26种化合物(图1，表1)。其中萜烯类化合物12种，醇类化合物8种，以及少量的酯类、酮类、酸类和其他化合物，主要成分为(1R)-(+)-α-蒎烯、莰烯、α-石竹烯、桉树醇和邻异丙基甲苯等。从3月到12月，检测到叶片释放的挥发性有机物种类数量呈现先上升后下降趋势，在6月份达到最多，为22种，3月份检测到的种类最少，仅为6月份的二分之一(图2)。3月份检测到的挥发性有机物的种类以萜烯类为主，但醇类物质的相对含量较萜烯类高。其中桉树醇的相对含量最高，为74.58%，其次为邻异丙基甲苯、莰烯、右旋樟脑和(1R)-(+)-α-蒎烯，其相对含量分别为6.65%、4.83%、4.54%和4.03%。6月份检测到的挥发性有机物成分主要是萜烯类和醇类化合物，较3月份分别增加4种和5种，并检测到了酸类物质。各组分的相对含量仍以桉树醇为最高，其次为邻异丙基甲苯、(1R)-(+)-α-蒎烯和莰烯。9月和12月份检测到的挥发性有机物种类较6月份有所减少，主要表现在萜烯类和醇类物质的数量上。

表1 花叶艳山姜叶片释放的挥发性有机物成分及相对含量的季节变化

“-”：未检测到或不存在

“-”:Not detected or not existed

图1 花叶艳山姜叶片不同季节释放挥发性有机物的总离子流图Fig.1 The TIC of VOCs released from leaves of A.zerumbet cv.Variegata in different seasons

由图2可以看出，一年中不同季节，花叶艳山姜叶片释放的酯类物质的相对含量呈现先上升后下降的趋势，在9月份含量最高，3月份含量最低，仅为9月份的六分之一；萜烯类物质含量的变化趋势同酯类相同，但在6月份其相对含量达到最高，为25.93%；酮类物质总体呈下降趋势，且在12月份并未检测到该类化合物；醇类化合物的相对含量从3月到9月呈下降趋势，9月份最低，12月份其含量有所回升；其他物质中的含苯化合物的相对含量则呈现持续升高趋势。其主要成分的变化趋势如下：桉树醇的相对含量呈现高-低-高的趋势，α-石竹烯、β-月桂烯和邻异丙基甲苯则呈现低-高-低的变化趋势，(1R)-(+)-α-蒎烯和莰烯的相对含量呈现低-高-低-高的变化趋势。

图2 一年中不同季节花叶艳山姜叶片释放的各类挥发物数量和相对含量的变化Fig.2 The component numbers and relative contents of classified VOCs from leaves in different seasons of a year

英文名称English name中文名Chinese name相对含量/% Relative content8:0010:0012:0014:0016:0018:0020:002-Propenoic acid,3-phenyl-,methyl ester肉桂酸甲酯1.151.480.961.001.320.941.621R-.α.-Pinene(1R)-(+)-α-蒎烯8.909.7210.1111.8510.8311.2810.43Bicyclo[2.2.1]heptane,2,2-dimethyl-3-methylene-,(1S)-(-)-莰烯4.836.545.53-6.28--.β.-Phellandreneβ -水芹烯2.33------.β.-Myrceneβ-月桂烯3.092.883.443.282.613.021.68Bicyclo[4.1.0]hept-2-ene,3,7,7-trimethyl-δ-2-蒈烯0.280.30-0.330.290.310.251,3-Cyclohexadiene,1-methyl-4-(1-methylethyl)-α-萜品烯0.16-0.13----1,4-Cyclohexadiene,1-methyl-4-(1-methylethyl)-γ-萜品烯0.430.330.930.890.680.840.27Caryophyllene石竹烯0.950.540.670.570.650.560.25.α.-Caryophylleneα-石竹烯3.101.531.991.752.151.800.49Naphthalene,1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydr o-7-methyl -4-methylene-1-(1-methylethyl)-,(1.α.,4a.β.,8a.α.)-(-)-g-荜澄茄烯0.310.350.280.230.320.240.261H-Cyclopropa[a]naphthalene,1a,2,3,3a,4,5,6,7b -oc-tahydro-1,1,3a,7-tetramethyl-,[1aR-(1a.α.,3a.α.,7b.α.)]-未命名0.08------Bicyclo[3.1.1]heptane,6,6-dimethyl-2-methylene-,(1S)-(1S)-(-)-β-蒎烯-2.08-----Bicyclo[3.1.0]hex-2-ene,2-methyl-5-(1-methyleth-yl)-3-柠烯--0.63---0.46Bicyclo[3.1.0]hexane,4-methylene-1-(1-methylethyl)-桧烯--0.84-2.65--.β.-Pineneβ-蒎烯--1.902.82-2.461.78Cyclohexene,1-methyl-4-(1-methylethylidene)-萜品油烯--0.31----Camphene莰烯---6.68-6.727.46Naphthalene,decahydro-4a-methyl-1-methylene-7- (1-methylethenyl)-,[4aR-(4a.α,7α,8a.β.)]-β-桉叶烯----0.10--3-Carene3-蒈烯------0.28Phenol,4,4'-(1-methylethylidene)bis-聚丁基双酚-A0.38------Bicyclo[2.2.1]heptan-2-one,1,7,7-trimethyl-,(1R)-右旋樟脑2.072.381.691.911.812.102.122-Butanone,4-phenyl-4-苯基-2-丁酮-0.23----0.12n-Hexadecanoic acid棕榈酸5.240.060.070.070.110.060.06Oleic Acid油酸2.05------Octadecanoic acid硬脂酸0.03------12-Oxabicyclo[9.1.0]dodeca-3,7-diene,1,5,5,8-tet-ramethyl-,[1R-(1R*,3E,7E,11R*)]-葎草烯环氧化物0.37----0.28-1,3,5-Triazine-2,4-diamine,6-phenyl-苯并胍胺1.230.070.080.080.160.100.08Benzene,1-methyl-2-(1-methylethyl)-邻异丙基甲苯13.5717.7815.6415.8213.7215.3117.103,6-Dimethyl-2,3,3a,4,5,7a-hexahydrobenzofuran未命名-0.200.270.25--0.24Eucalyptol桉树醇46.9350.5851.2250.3654.0951.8053.471,6-Octadien-3-ol,3,7-dimethyl-芳樟醇1.921.471.791.541.771.631.053-Cyclohexen-1-ol,4-methyl-1-(1-methylethyl)-4-萜烯醇0.140.170.160.170.140.180.203-Cyclohexene-1-methanol,.α.,.α.4-trimethyl-α-萜品醇0.480.360.420.42-0.39-3-Hexen-1-ol,(Z)-顺-3-己烯-1-醇-0.780.78----Benzenepropanol,.β.-methyl-β-甲基-苯丙醇-0.08-----1,6,10-Dodecatrien-3-ol,3,7,11-trimethyl-,(E)-反式-橙花叔醇-0.090.17-0.34--3-Cyclohexene-1-methanol,.α.,.α.,4-trimethyl-,(S)-松油醇、萜品醇------0.35

“-”：未检测到或不存在

“-”:Not detected or not existed

2.2 花叶艳山姜叶片挥发性有机物成分和含量的日变化

花叶艳山姜叶片在08:00、10:00、12:00、14:00、16:00、18:00、20:00时释放的挥发性有机物，通过GC/MS分析，扣除本底空气中的杂质，共鉴定出38种化合物(表2)。其中萜烯类化合物19种、醇类化合物8种、酸类化合物3种，以及少量的酮类、酯类、烷类和其他类化合物，主要成分为(1R)-(+)-α-蒎烯、β-月桂烯、邻异丙基甲苯、桉树醇等。一天中不同时段叶片释放的挥发性有机物种类存在差异(图3)，从08:00到12:00叶片释放的挥发性有机物种类维持在24种，12:00之后种类逐渐下降到19种，20:00时种类数又增加到22种。08:00到12:00检测出的挥发性有机物种类以萜烯类最多，其次是醇类化合物，但醇类物质的相对含量高于萜烯类化合物的含量。其中桉树醇、邻异丙基甲苯、(1R)-(+)-α-蒎烯和(-)-莰烯的相对含量较高。14:00到18:00检测出的挥发物种类较12:00时减少，主要表现在萜烯类物质和醇类物质数量的减少。20:00时检测到的挥发物种类较18:00时增加，但仍然低于12:00前的数量，其中酯类物质的相对含量达到一天中最高。一天中，每个时间段都检测到的化合物有肉桂酸甲酯、(1R)-(+)-α-蒎烯、β-月桂烯、α-石竹烯、γ-萜品烯、石竹烯、(-)-g-荜澄茄烯、右旋樟脑、棕榈酸、苯并胍胺、邻异丙基甲苯、桉树醇、芳樟醇和4-萜烯醇。

从图3可以看出，一天中不同时段，花叶艳山姜叶片释放的酯类物质的相对含量变化曲线呈现三峰两谷，在18:00时相对含量最低，20:00达到最高；萜烯类物质的相对含量呈现先上升后下降的趋势，其相对含量在14:00时最高，为28.39%；醇类化合物的相对含量在总挥发物含量中一直保持最高，在小范围内震荡变化；烷类和酸类化合物在08:00时含量最高，且烷类化合物仅在08:00出现；酮类化合物的相对含量变化较小。其主要成分的变化趋势如下：(1R)-(+)-α-蒎烯的相对含量呈现低-高-低的变化趋势，β-月桂烯呈现高-低-高-低的变化趋势，邻异丙基甲苯和桉树醇的相对含量呈现低-高-低-高的变化趋势。

图3 1 d中不同时段花叶艳山姜叶片释放的各类挥发物数量和相对含量的变化Fig.3 The component numbers and relative contents of classified VOCs from leaves in different time of a day

2.3 花叶艳山姜花与叶片挥发性有机成分和含量的对比分析

通过花叶艳山姜叶片与花瓣的SPME/GC/MS总离子流图分析，扣除本底空气中的杂质，在花叶艳山姜叶片和花瓣中一共鉴定出22种挥发性有机物，其中萜烯类化合物17种，酯类、醇类和酮类化合物各1种(表3)。叶片共检测出11种挥发性成分，其中萜烯类化合物最多，为7种，但醇类化合物的相对含量最高，为74.58%。而在花瓣中共检测出21种挥发性有机物质，其中萜烯类化合物为17种，占花瓣总挥发物含量的54.37%，其次为醇类物质，占21.44%。叶片中检测到的含量最多的挥发性成分是桉树醇，为74.58%，其次为邻异丙基甲苯和莰烯，其相对含量分别为6.65%和4.83%。花瓣中检测到的含量最多的挥发性成分是(1R)-(+)-α-蒎烯，含量为22.09%，其次是桉树醇和间异丙基甲苯，其相对含量分别为21.44%、20.83%。花叶艳山姜叶片与花瓣中都检测到的挥发性有机物一共有10种，分别为肉桂酸甲酯、(1R)-(+)-α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、石竹烯、α-石竹烯、(-)-g-荜澄茄烯、右旋樟脑和桉树醇。

表3 花叶艳山姜叶片与花瓣释放的挥发性有机物成分及相对含量

“-”：未检测到或不存在

“-”:Not detected or not existed

3 讨 论

大多数研究者常采用水蒸气蒸馏法对艳山姜挥发物进行提取，此方法虽然简单易行，但非活体提取，长时间高温提取会使某些挥发性物质受到破坏。而本研究采用固相微萃取采集法，所需样品量少，无需溶剂，操作简化，集采样、萃取、浓集、进样于一体，非常适合芳香植物挥发性成分的研究，已在植物的香气成分分析中得到应用[24-26]。

前人对植物挥发性有机物释放规律的研究表明，挥发物释放的种类和相对含量与采样时温度、湿度、气孔导度、光照以及蒸腾速率等关系密切[17-19,21,23]。一年中花叶艳山姜叶片检测到的挥发性有机物种类数量先上升后下降，在6月份达到最多，为22种，3月份检测到的种类最少，仅为6月份的二分之一。这可能是因为3月份光照时间较短，温度都较低，此时植物体内合成代谢较慢，生长较慢，因此形成的VOCs种类较少；而随着夏季的到来，光照时间变长，温度逐渐升高，达到30 ℃左右，植物进入生长旺盛阶段，植物自身旺盛的光合作用为有机物合成提供充足的碳源和还原力，体内有机物合成、代谢加快，强烈的蒸腾作用也为有机物的扩散创造了条件，其挥发性有机物的种类增多[27-29]。一天中不同阶段，花叶艳山姜叶片释放的挥发性有机物种类在12:00达到高峰，这也说明随着外界环境条件的改变，植物自身的代谢活动随之变化，从而影响植物VOCs的合成和释放。叶片释放挥发性有机物种类的多少和相对含量的高低与外界环境以及植物自身条件的密切相关，这有待后续进一步深入的研究。植物发育部位的差异和所处发育阶段的不同对VOCs的释放也具有十分重要的影响[30-32]。试验结果显示，花叶艳山姜花瓣所含的挥发性有机物种类要明显高于叶片；叶片中检测到的含量最多的挥发性成分是桉树醇，为74.58%，而花瓣中检测到的含量最多的挥发性成分是(1R)-(+)-α-蒎烯，含量为22.09% 。在叶片和花瓣中共同检测到的物质中，大部分成分在花瓣中的含量要高于叶片。

近年来，随着科研人员对植物挥发性有机物研究的深入，植物挥发性有机物的药用保健作用日益被人们所重视[33-34]。研究发现不同植物的气味对人体产生不同的影响，一部分植物的挥发性气味能够提高人脑α-波的活动，使人情绪趋于放松状态，感觉清新、舒爽；例如，柠檬油、雪松醇、龙脑和1,8-桉叶油能够降低心率和血压[35]，月季(Rosachinensis)、菊花(Chrysanthemum×morifolium)、雪松(Cedrusdeodara)、侧柏(Platycladusorientalis)、薰衣草(Lavandulaangustifolia)、檀香(Santalumalbum)等植物的气味可以使人情绪趋向松弛[36-37]。另一部分植物的挥发性气味可以提高人脑β-波的活动，使人情绪趋向紧张、焦虑或不快，例如，珍珠梅(Sorbariasorbifolia)[37]、香樟(Cinnamomumcamphora)[38]等植物。本试验测得花叶艳山姜的主要成分为(1R)-(+)-α-蒎烯、β-月桂烯、莰烯、右旋樟脑、桉树醇等，它们中的部分成分具有药用、保健功效。如：蒎烯类物质可以杀菌抗菌、抗癌、利胆消炎、医疮止痒，并对人体呼吸系统、心血管系统、中枢神经系统等有保健作用[39]；β-月桂烯具有降血糖、防癌的功效[40-41]；莰烯具有杀菌、抗菌的作用[42]；右旋樟脑可除湿杀虫，温散止痛[43]；桉树醇具有驱虫、调理肠胃胀气，止咳化痰，有助入眠的功效[44,45]。这说明花叶艳山姜释放的挥发性有机物具有药用、保健的作用，是营造保健型园林景观的理想植物。