5个新育成转Bt基因抗虫恢复系配合力分析

欧阳林娟，孙 玥＊，彭东华,王春雷，周大虎，傅军如，贺晓鹏，贺浩华*，彭小松*

(1.江西农业大学 农学院/作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室/江西省超级稻工程技术研究中心/双季稻现代化生产协同中心，江西 南昌 330045；2.江西省赣州市农业科学研究所，江西 赣州 341000)

杂交水稻因高产，广适，多抗等优点，迅速被应用于生产并被大面积推广，为中国乃至世界的粮食安全做出了极大的贡献[1]。然而近几年，杂交水稻也面临着一些新的机遇与挑战。一方面，鳞翅目昆虫中仅二化螟、三化螟等害虫在亚洲造成的稻谷损失就占总产的10%左右，而广泛使用农药既增加种植投入又破坏水土，与此同时我国面临着城市化和劳动力流向城市的严峻形势，如何减少农药既人工打药的高成本投入日渐成为亟需解决的问题[2-3]。另一方面，大米消费市场中优质常规稻米赢得了越来越多消费者的青睐，杂交稻米由于品质较差往往低价销售，这严重挫伤了广大农民种植杂交稻的积极性,但目前杂交水稻整体而言品质还难以和常规稻匹敌，特别是在整精米率、垩白和食味性状上，选育和鉴定一批优质骨干亲本已迫在眉睫[4-6]。培育抗虫、优质的杂交稻亲本是解决上诉问题的主要办法，而评价这些种质资源在育种的作用，主要看其配合力[7]。为了评价5个新育成的转Bt基因抗虫恢复系的利用价值，以江西农业大学新选育的5个转Bt基因抗虫恢复系为父本，7个三系野败型不育系为母本，按照5×7不完全双列杂交试验设计[8]，并利用分子标记辅助选择[9]，筛选出特殊配合力效应值较高的14个配组后代，将这14个组合送检农业部国家稻米品质检测中心(武汉)，筛选出2个组合米质到达国优3级。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 转基因恢复系 昌恢121T、昌恢606T、昌恢891T、昌恢T025T和R205T。

1.1.2 不育系 泰丰A、荃9311A、洪A、67A、润丰A、843A和5957A。

1.1.3 试剂 1.5×CTAB；氯仿/异戊醇(24∶1)；无水乙醇；引物(序列见表1，由上海生工公司合成)；Buffer；Taq酶；dNTP；琼脂糖；GelRed等。

表1 BT基因扩增引物

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验以7个不育系和5个恢复系，采用不完全双列杂交，2016年春在海南三亚江西农业大学南繁试验基地配制35个组合。2016年夏将35个组合种植于江西农业大学试验田，秧田釆用露地湿润育秧，5月19日播种，6月25日移栽。田间试验按随机区组设计，每个小区栽插3行，每行10株，单本植，3次重复。

1.2.2 分子标记辅助检测 进行PCR扩增。将PCR扩增产物置于10 g/L琼脂糖凝胶电泳上检测。以DNA Marker DL-2000为分子标记，电泳结果利用凝胶成像分析仪进行拍照观察。

1.2.3 免疫金试纸条转基因植株Bt蛋白定性检测 剪取分蘖期叶片置于2.5 mL离心管中，加入提取缓冲液并用玻璃棒将叶片汁液碾出，用免疫金试纸条蘸取混合液后观察结果。

1.2.4 配合力效应的数据统计与分析 配合力分析釆用SPSS数据处理系统和Excel 2003进行方差分析，一般配合力(GCA)、特殊配合力效应值(SCA)估算，配合力方差贡献率分析，结实率利用Excel反正弦平方根转换。NCII遗传交配设计模型为：Yijk=μ+gi+gj+gij+εijk，其中Yijk为一组亲本i(母本)与另一组亲本j(父本)的杂交组合第k次重复的表型值，μ为所有组合的均值，gi为第i个母本一般配合力效应，gj为第j个父本—般配合力效应，gij为亲本i与亲本j的杂交组合特殊配合力效应，εijk为试验误差[10]。

1.2.5 性状考察 考察材料主要农艺性状，主要包括植株株髙、穗长、有效穗数、每穗总粒数、每穗实粒数、千粒质量、空批粒数、结实率和单株产量。在水稻完熟期收取连续3株，带回实验室进行考种并记录，筛选出产量性状好的杂交组合，收取300 g稻谷送至农业部食品质量监督检验测试中心(武汉)检测。

2 结果与分析

2.1 分子标记检测结果

取分蘖期叶片抽提水稻DNA，通过PCR及琼脂糖水平电泳检测，显影后确定35个F1能够扩增出片段长度为600 bp、799 bp的cry1C、cry2A(含同时转两个抗虫基因的材料)，确定这些F1代杂交组合为阳性植株。

Marker：1；转基因F1组合实验材料:3、5、7、9、11和13;非转基因F1组合作阴性对照:2、4、6、8、10、12和14Marker：1；the research materials were transgene F1 hybrid:3，5，7，9，11，13；the negative control were non-transgene F1 hybrid：2，4，6，8，10，12，14图1 琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Agarose gel electrophoretogram

2.2 免疫金标速测卡检测结果

使用上海佑隆公司免疫金标速测卡检测发现，35个杂交组合均显示出质控线，与分子标记检测结果吻合，进一步验证实验的准确性。

蛋白阳性植株，质控线和检测线均出现Positive plants of protein which had line of quality control and line of detecting图2 试纸条检测结果Fig.2 Results of test paper detection

2.3 配合力方差分析

通过分析35个组合中9个农艺性状的方差，由表2可知，每个性状在不同材料间存在极显著差异，说明试验材料间存在明显的差异。分析父本的一般配合力方差可知，除单株产量外其他性状的一般配合力方差均达到极显著水平，而母本的一般配合力方差中，所有性状的一般配合力方差均达到极显著水平。分析母本/父本组合间的特殊配合力方差可以发现，除千粒质量外其他性状的特殊配合力方差均达到极显著水平。

表2 35个组合9个产量性状的配合力方差分析

**表示差异0.01水平显著性,*表示差异0.05水平显著性

**significant at 0.01 level，*significant at 0.05 level

2.4 亲本的一般配合力效应分析

由表3可知，7个不育系和5个恢复系的9个农艺性状一般配合力(GCA)效应值均存在明显差异，说明亲本加性效应对于不同亲本、不同性状的作用程度不同。

表3 各亲本产量及相关性状的一般配合力(GCA)效应值

在参试恢复系中，株高GCA效应值以昌恢606T最高为-1.93，在提升其组合抗倒性上起到很大的贡献；昌恢121T实粒数GCA效应值为20.71，明显高于同类恢复系；昌恢T025T穗长、总粒数、单株产量GCA效应值分别为2.01、43.49，明显高于同类恢复系；单株产量是反应组合产量大小的直接因素，单株产量GCA效应值最高的是昌恢T025T，达到4.11，其次是昌恢121T、R205选T、昌恢606T、昌恢891T，分别为3.66、-0.52、-3.02和-4.23。昌恢891T千粒质量GCA效应值最高为1.83，在提升其组合粒重上起到很大的贡献。综上5个新转Bt基因抗虫恢复系产量构成相关性状GCA效应值，昌恢T025T效应最高，昌恢121T、R205选T其次，昌恢606T、昌恢891T效应最低。

在参试不育系中，株高的GCA效应值，较低的依次为润丰A、843A、泰丰A、5957A、荃9311A、67A和洪A，其中润丰A和843A的株高GCA效应值最低，在提升其组合抗倒性上起到很大的贡献；67A穗长GCA效应值最高；在构成组合产量性状方面，有效分蘖和千粒质量的GCA效应值最高是荃9311A，实粒数GCA效应值最高是洪A，总粒数和结实率GCA效应值最高是67A，单株产量GCA效应值最高的是洪A，其他较高的依次为荃9311A、润丰A、67A、泰丰A、5957A和843A。

表4 72个组合产量及相关性状特殊配合力(SCA)效应值

2.5 F1配组后代的特殊配合力效应分析

单株产量是水稻单产的决定因素，由表4可知，35个组合单株产量SCA效应值变幅为-22.66～22.62，有18个组合特殊配合力(SCA)效应值为正值，较高的依次为67A/R205T(22.62)、荃9311A/昌恢T025T(19.01)、洪A/昌恢121T(15.72)和843A/昌恢891T(15.52)，其中67A/R205T单株产量SCA效应值最高，为22.62；对产量性状相关的4个性状(包括有效穗数、总粒数、结实率、单株产量)SCA效应值进行综合评价，荃9311A/昌恢T025T每穗实粒数(23.84)、总粒数(16.17)、结实率(0.02)和单株产量(19.01)具有较高的SCA效应值，而株高(-0.99)、空瘪粒数(-7.58)具有较低的SCA效应值，该组合可能是一个高产组合；株高是决定水稻抗倒性的主要因素之一，在2016年9月台风环境压迫下，株高SCA效应值最小的是843A/昌恢606T(-8.78)，说明843A/昌恢606T可能具有较好的抗倒伏能力；穗长SCA效应值最大的是843A/昌恢891T(2.21)，最小的是荃9311A/昌恢891T(-2.54)；空瘪粒数是限制水稻产量的主要因素之一，在2016年7月底抽穗期高温环境压迫下，35个组合空瘪粒数SCA效应值变幅为-41.66～45.04，有16个组合空瘪粒数SCA效应值为负值，843A/昌恢121T空瘪粒数SCA效应值最低为-41.66，结实率SCA效应值最高为0.23，说明843A/昌恢121T可能是一个耐高温组合。特殊配合力效应值在同一组合的不同性状间和同一性状的不同组合间存在显著差异，说明这些材料的基因间互作是非常复杂的。

2.6 基因型方差贡献率估算

为了清楚地了解亲本对后代杂种优势的影响，试验对9个农艺性状的基因型方差贡献率进行了估算。从表5可以得知，所有性状的一般配合力方差贡献率(GCA%)均大于特殊配合力方差贡献率(SCA%)，说明材料的主要农艺性状受基因加性效应控制，亲本的一般配合力在选配组合过程中占主导作用，亲本是决定组合好坏的关键因素。由双亲的一般配合力方差贡献率(GCA%)可知，母本对株高、有效分蘖、每穗实粒数、总粒数、结实率、单株产量的贡献率大于父本，而父本对穗长、空瘪粒数、千粒质量的贡献率大于母本，说明父、母本对杂交一代各性状的贡献率有着重要的作用，但不同性状贡献率的侧重方向不同；另外值得注意的是，有效分蘖和千粒质量的特殊配合力方差贡献率占了相当大的比值，说明这两个性状受双亲基因互作影响较大。

表5 9个农艺性状的基因型方差贡献率

2.7 组合的品质性状检测

选取14个产量相关性状SCA效应值较高的组合，将14个组合的稻谷送至农业部国家稻米品质检测中心(武汉)检测，两个组合达到国家米质3级，分别为荃9311A/昌恢T025T、龙S/昌恢121T(表6)。

表6 2个杂交组合的10个品质性状

3 结论与讨论

一般配合力(GCA)效应值分析表明，在5个新育成的转Bt基因抗虫恢复系中，昌恢T025T和昌恢121T的单株产量GCA效应值排名前两位，分别为4.11和3.66，这两个恢复系配出的组合单株产量较好，可以成为较好的亲本材料；R205选T和昌恢606T配出的组合单株产量一般，单株产量GCA效应值分别为-0.52和-3.02；昌恢891T单株产量GCA效应值最低为-4.23。在7个不育系中，洪A和荃9311A的单株产量GCA排名前两位，分别为19.62和17.60，这两个不育系配出的组合单株产量较好。特殊配合力(SCA)效应值分析表明，在荃9311/昌恢T025T的SCA效应值中，穗长为1.23,实粒数为23.84，总粒数为16.17，千粒质量为1.02，单株产量为19.01，产量相关性状的SCA效应值综合评价最好；67A/R205T的单株产量SCA效应值最高为22.62；843A/昌恢121T的结实率SCA效应值最高为0.23。昌恢T025T和荃9311A的单株产量GCA效应值都较高，所配组合荃9311/昌恢T025T的单株产量SCA效应值也较高，说明只有选育出农艺性状好的亲本，才能配组得到农艺性状好的组合。通过分析基因型方差贡献率可知，9个农艺性状的一般配合力方差贡献率均大于特殊配合力方差贡献率，结果表明在亲本与子代的遗传力方面，基因加性效应比基因非加性效应的作用更强。最后，通过配合力分析结合田间实际育种经验，研究发现江西农业大学新培育的转Bt基因抗虫恢复系昌恢T025T、昌恢121T是配合力强的亲本材料，荃9311/昌恢T025T是一个综合表现较好的转Bt基因抗虫杂交组合材料。