实时荧光定量PCR方法在石蜡包埋组织中结核分枝杆菌检测意义

张美兰，沈哲式，张英哲，金仁顺

(延边大学附属医院病理科，吉林 延吉 133000)

结核病(tuberculosis)是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性肉芽肿性病，以肺结核病最为常见，但亦见于全身各脏器和器官，危害性极大。虽然近年国内部分省结核病得到有效的控制，呈稳定下降趋势,但我国还是全球结核病流行严重的国家之一[1-4]。为了促进我国结核病病理学诊断水平，2017年中华医学会提出了“中国结核病病理学诊断专家共识”。共识提出了结核病的病理诊断标准，即在结核病基本病理变化的基础上，结核分枝杆菌基因检测阳性才能做出明确的结核病诊断[5]。结核病的分子病理学检测方法有多种，其中实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法已被广泛利用于临床[6-8]，但检测痰、血液、胸腹腔积液和脑脊液等标本中的结核分枝杆菌阳性率较低。本试验对组织学上诊断为结核病以及伴有坏死、肉芽肿但不能明确诊断结核病的石蜡包埋组织标本，采用FQ-PCR技术进行结核杆菌核酸检测，与抗酸染色的结果进行对比分析，探讨FQ-PCR技术在结核病诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1标本来源： 选择2014年5月～2017年11月间我院手术切除、手术活检和穿刺活检，并在病理科进行常规切片染色后诊断为结核病的87例及伴有少量坏死和肉芽肿性炎，但在组织学上不足诊断结核病的病例58例做对照，具体的标本来源见表1。145例中男77例，女68例，对所有标本进行FQ-PCR检测，其中对49例同时做抗酸染色进行对比。

1.2FQ-PCR结核分枝杆菌检测方法：将石蜡包埋组织切8～10片，厚度为5～10 μl，放入离心管中加入1 ml二甲苯脱蜡，加入1ml无水乙醇离心进行脱水，之后加入20 μl蛋白酶K提取石蜡包埋组织中的DNA；利用实时荧光定量PCR仪(ABI7500)进行扩增检测，反应体系为40 μl：TB PCR反应液37.8ul，Taq酶0.2 μl，UNG 0.06 μl，样本2 μl。循环条件：37℃，5 min；94℃，1 min；95℃，5 sec；60℃，30 sec，40个循环。

1.3结果判读：检测样本Ct值为40，0或无数值报告为阴性，见图1；检测样本Ct值≤37.0，且有典型的S型曲线，为阳性，见图2；检测样本Ct值>37.0重新检测，若样本Ct值<40可报告为阳性，否则为阴性。

1.4抗酸染色：石蜡组织3～4 μm厚切片，用汽油松节油脱蜡，按照试剂盒说明进行染色，阳性判读标准：结核分枝杆菌呈红色，长约3 μm，呈纤细而微弯的杆状物或串珠状物，也可以长或较短粗，散在或成堆排列，其他细菌及细胞呈蓝色，在高倍镜下观察全部切片，未发现者判为阴性，找到>3条判为阳性。

表1145例标本来源及病理诊断为结核病的87例FQ-PCR检测结果[例(%)]

部位总例数结核例数阳性阴性肺及胸壁605044(88.0)6(12.0)淋巴结1676(85.7)1(14.3)鼻咽、扁桃体974(57.1)3(42.9)附睾,肾1265(83.3)1(26.7)肠、大网膜1363(50.0)3(50.0)子宫、乳腺633(100.0)0(0.0)皮下组织1500(0.0)15(0.0)其他1485(62.5)3(37.5)合计1458770(80.5)17(19.5)

注：其他部位包括涎腺、腹腔、盆腔、脾脏、前列腺等

图1 TB-DNA 阴性曲线

图2 TB-DNA 阳性曲线

1.5统计学方法：采用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析，采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在145例检测标本中74例FQ-PCR检测结果阳性，占51%，在组织学上诊断为结核病的87例中70例为阳性，阳性率为80.5%(70/87)，其中肺及胸壁阳性率最高(62.9%)，其次是淋巴结(8.6%)，见表1，在组织学上无足够证据诊断结核，考虑为慢性溃疡，结节病和慢性肉芽肿性炎的4例，FQ-PCR检测呈阳性。同时进行抗酸染色的49例标本中，单纯抗酸染色阳性者14例，占28.6%，其阳性率明显低于FQ-PCR染色，差异有统计学意义(P<0.001)，两种检测方法同时阳性者9例，占78.5%，有较高的一致性。见表2、3。

表2FQ-PCR及抗酸染色检测结果(例)

临床诊断例数FQ-PCR + - 例数抗酸染色 + - 结核877017321121非结核5845417314合计1457471491435

表3抗酸染色与 PCR检测结果的关系(例)

抗酸染色FQ-PCR 阳性 阴性 合计阳性113 14阴性211435合计321749

3 讨论

近年我国结核病发病率稳步下降，但肺结核患者数仍居全球第二位[4]。临床常用的结核病原体检查方法是痰、胸腹水、血液中的结核分枝杆菌培养法，但培养时间长，敏感度低。在组织学上典型的结核病易诊断，但随着非结核分枝杆菌的感染率上升及不典型结核病变以及耐药结核病患者增加[9]，有时单靠组织学特征诊断困难。

本文选择在组织学上诊断为结核病的87例蜡块组织，进行FQ-PCR法检测，结果发现70例呈阳性，阳性率为80.5%，在阳性标本中肺和胸膜组织最多，其阳性率也最高，其次是淋巴结、鼻咽和扁桃体等，提示肺结核病为最常见。近年随着支气管镜的广泛开展，肺黏膜活检越来越多，因此，在肺活检标本中结核病检出率越来越高[10]，本组FQ-PCR法检测阳性标本中有11例为肺活检标本，部分病例在组织学上仅见少量类上皮样细胞及小的结核样结节，但FQ-PCR法检测均为阳性，因此，认为FQ-PCR检测方法敏感性高，尤其对小标本的检测值得临床推广。近年来，陆续发现喉、扁桃体等开放性脏器的结核病，但这些部位的结核病临床症状不典型，取活检困难，标本小，有时在传统的HE染色上病变不典型诊断更困难。本组中7例疑结核病的扁桃体、喉和会厌活检小标本中4例为阳性，最后可以明确结核病的诊断。

抗酸染色作为病理诊断的辅助检查方法已广泛应用于临床，但有局限性。此染色不仅结核分枝杆菌呈阳性，而非结核分枝杆菌如麻风杆菌也呈阳性。另外，因杆菌较小在镜下观察有一定的难度，并具有观察者的主观差异，尤其是活检小标本菌量少的易漏诊[10]。本文中笔者对49例同时进行抗酸染色和FQ-PCR检测进行对比，结果发现TB-DNA阳性率明显高于抗酸染色，提示FQ-PCR检测石蜡组织中的结核杆菌具有灵敏度高、特异性强，优于抗酸染色，并可以区分结核杆菌与非结核杆菌，提高结核杆菌的检出率[6-8，10]。本组中2例肺组织和1例胸膜组织抗酸染色阳性，但FQ-PCR阴性，其可能原因是：①可能其他抗酸染色阳性的分枝杆菌感染；②活检小标本因组织过小、组织较大的蜡块在切取蜡块组织时修片过多，导致在FQ-PCR检测用的组织片里没有病变组织；③FQ-PCR操作原因：在核酸提取过程中，因组织小丢失DNA、提取不纯、或抑制物影响扩增等原因均可导致假阴性。通过本研究笔者认为对小活检或穿刺标本石蜡不要进行修片，尽可能提高模板DNA的含量；对组织较大的蜡块标本，对照常规HE染色进行修片，以便提高阳性率。

综上所述，利用FQ-PCR技术检测石蜡组织中的结核分枝杆菌，具有灵敏度高，特异性强的特点，但也可能存在假阴性，因此，应在病理形态学的基础上结合抗酸染色，严格遵守FQ-PCR操作规范，以便提高结核分枝杆菌检出率及诊断率。