抑抗汤对子宫内膜容受性作用的影响

余军辉，应柳青，王珺

不孕症属于妇科常见疾病，临床发病率达到10%～25%[1]。经过标准的检查程序后，多数可明确病因；但仍有10%～26%不孕症患者原因不明。近年来随着辅助生殖技术的应用，不孕患者的妊娠率从15%～20%提高到了32.5%，但相对来说其胚胎植入效率仍相对较低[2]。不孕症患者中约三分之一是由于胚胎的卵母细胞出现异倍性现象或者染色体畸形而引起的，但其中三分之二都是因为子宫内膜的容受性而引起的[3]。随着医学领域对围着床期各种调节因素的研究开始深入，发现引起不明原因不孕症的病因可能是由于患者子宫内膜局部调节失衡[4]。因此，本实验将着重研究抑抗汤对于改变白血病抑制因子（LIF）水平与提高胚胎着床率的机制，具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物与药物 选取8～12周龄、体质量25～30g、无特定病原体ICR雌鼠74只。按照随机数字表法分为A组与B组。A组大鼠体质量（27.54±2.32）g，周龄（10.26±1.63）周；B组大鼠体质量（27.60±2.29）g，周龄（10.32±1.58）周。两组大鼠体质量、周龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 配置抑抗汤 选用白芍、山药、生地黄、赤芍、菟丝子、当归各10g，春柴胡、山茱萸，甘草各3g，采用水煎醇沉工艺煎煮配制中药，配置完成后对抑抗汤进行低温保存。选取其他实验所用药剂。

1.2.2 实验细胞的分离与制备 A组每天灌胃0.9%氯化钠注射液0.8 ml，B组连续每天定时（16时）以0.8 ml抑抗汤灌胃给药。1个月后均于末次给药1 h后，颈椎脱臼处死，立即心脏采血。低温－4℃离心（4000r/min）20min，吸取上清液。56°水浴30 min灭活，0.22m一次性滤器过滤除菌，－80℃保存备用。

重新选择74只雌鼠，按照奇数与偶数分为对照组和研究组。对照组大鼠体质量（26.78±1.67）g，周龄（9.65±1.48）周；研究组大鼠体质量（27.09±1.85）g，周龄（9.58±1.53）。两组大鼠体质量、周龄差异无统计学意义（均P＞0.05）。

按雌雄比例（1～2）∶1合笼，次日晨查雌鼠阴道，发现阴栓者计为妊娠第1天；均于妊娠第4天将雌鼠颈椎脱臼处死，迅速无菌取出子宫组织，置于4℃遇冷的PBS中，去除脂肪厚组织后，清洗，将子宫沿长轴剖开，置于含 HBSS 4 ml，Trypsin（10%）1 ml的消化液中消化4℃1h→20℃1h→37℃10min；消化结束后采用低速离心的方法收集子宫内膜细胞，放置在37℃孵箱中处理。取已制备好的抑抗汤含药血清和0.9%氯化钠注射液灌胃血清，分别对对照组与研究组的妊娠第4天大鼠的子宫内膜细胞进行培养。

1.3 观察指标 对照组和研究组子宫内膜的黏附能力及LIF与整合素av 3蛋白的表达水平。子宫内膜细胞黏附能力通过组内设30、60、90、120min及参照组，每组3个复孔，ELISA方法进行测定；LIF与av 3蛋白通过Western blot法进行测定。

1.4 统计方法 应用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，采用 检验；计数资料采用2检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

研究组的子宫内膜细胞 av 3蛋白水平与基质间黏附力均显著高于对照组（P＜0.05），见表1。

随着时间增加，两组细胞培养液中LIF蛋白水平都有所增加，研究组细胞培养液中LIF水平显著高于对照组（P＜0.05），见表2。

3 讨论

一次成功的妊娠需要良好的胚胎及子宫内膜容受性，临床治疗中经常有部分患者由于既往内膜反复刮宫导致内膜受损伤，在超声检测过程中发现内膜薄，采用试管方案仍无法达到理想的效果。子宫内膜完全脱落，将有利于新的内膜生长起来；但部分患者内膜不能完全脱落，将对内膜容受性造成影响。因此，需要研究一种行之有效的办法改善患者的子宫内膜容受性。

胚胎的成功着床即子宫内膜变为接受态、胚胎发育成为植入态，即子宫内膜与胚胎要同步发育；因此，子宫内膜的容受性是胚胎可成功着床的关键[5]。以往体外受精-胚胎移植失败的案例中，2/3的患者都是由于患者子宫内膜容受性发生变化而导致的失败。患者体内的激素、细胞因子与黏附分子等多种因素都可影响子宫内膜容受性的形成[6]。

LIF是目前国内外生殖领域的热门研究因子，可维持胚胎干细胞保持未分化状态[7]。在生殖过程中LIF可以发挥重要作用，但其工作时各类调控信号的具体作用、途径与交互网络机制都还未阐明。LIF在子宫内膜表面表达调节时，其采用的上游信号系统与发挥功能的下游信号系统还未形成完备理论网络，基因表达的具体分子机制需进一步研究[8]。近年来，医学届加大对抑抗汤的研究，就如何改变LIF水平与提高胚胎着床率的机制进行了更多相关实验，力求进一步证明传统中医药与现代胚胎移植技术相结合后可显著提高胚泡着床障碍不孕症妇女的孕育成功率，从而寻找到一条新的治疗女性不孕症的途径[9]。

整合素是一种受体，参与细胞与外界环境的过程，可连接介导细胞与细胞外基质、细胞外基质（ECM）等，是细胞表面可以黏附的分子之一。跨膜信号的传导过程如细胞与细胞、细胞与机制、细胞基质-细胞间进行识别时都需要整合素的参与，可以迅速适应环境发生的变化[10]。本文研究的av 3又称玻璃黏附蛋白受体，女性排卵5～6 d即胚胎着床期时，av 3可以在子宫内膜上皮细胞进行表达。女性子宫内膜容受性的检验指标之一就是av 3的含量，其在子宫内膜内的表达与LIF分泌具有一致性，存在时间与空间的特异性。

表1 两组子宫内膜细胞av 3蛋白水平与基质间黏附力比较 %

表2 两组细胞培养液中LIF水平比较 ng/ml

抑抗汤具有补肾、活血化瘀及清利湿热等功效，而中医认为着床困难及免疫性不孕症则是由于肾虚、淤血或湿热等原因引起，因此抑抗汤对于胚胎着床困难即子宫内膜容受性有作用[11]。本次实验中对两组子宫内膜细胞 av 3蛋白水平与基质间黏附力进行比较，研究组的子宫内膜细胞av 3蛋白水平与基质间黏附力均显著高于对照组（＜0.05）；随着时间增加，两组细胞培养液中LIF蛋白水平都有所增加，研究组细胞培养液中LIF水平显著高于对照组（＜0.05）。本实验可证明抑抗汤含药血清对于子宫内膜的容受性具有显著改善作用。

综上所述，抑抗汤可能对于对细胞的黏附功能有所增强，从而增加女性体内LIF水平与av 3蛋白的表达，从而改善对子宫内膜容受性。