黑枸杞水提物对小鼠疲劳 及运动性心肌损伤的改善作用

杨巨峰,王 奇,孙 晶,冯大志,*

(1.锦州医科大学体育教研部,辽宁锦州 121001 2.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001)

黑枸杞即黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.),为茄科(Solanceae)枸杞属(LyciumL.),是西北干旱地区一种有的多年生灌木野生植物。黑枸杞富含多糖、有机酸、不饱和脂肪酸、原花青素、蛋白质、氨基酸、黄铜类化合物、甜菜碱、多酚类化合物、维生素和矿物质等营养物质[1]。研究表明黑枸杞干果多糖的含量可达到10.89%～16.74%[2],花青素含量可达3690 mg/100 g,总花色苷的含量达386.9 mg/100 g[1]。已有研究表明黑枸杞不仅具有抗肿瘤、增强免疫[3],抗损伤[4]、降血糖[5]、降血脂[6]等作用,而且还有抗氧化[7-8]、抗疲劳[9]和抗心肌损伤[8]的作用。汪建红等[10]研究表明黑枸杞多糖能明显的抗疲劳作用,曹茸茸等[11]也证明藏药黑枸杞也有缓解小鼠运动疲劳的作用。目前,对黑枸杞各功能性成分的抗疲劳和抗运行性心肌损伤作用虽有一些研究,但黑枸杞果实的抗疲劳作用研究较少,而从心肌细胞形态学方面探究其抗损伤机制还尚未见报道,本实验通过小鼠耐力试验、抗疲劳血液生化指标及组织形态学方面探究黑枸杞水提物抗疲劳作用及对运动性心肌损伤的改善作用,为其成为功能性运动保健食品研制和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑枸杞 青海格尔木源鑫堂生物科技有限公司;西洋参胶囊 通化万通药业股份有限公司生产;血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血乳酸(blood lactic acid,BLA)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肝糖原(liver glycogen,LG)、肌糖原(muscle glycogen,MG)的试剂盒 南京建成生物工程研究所;Bouin’s固定液 北京索莱宝科技有限公司;SPF级健康昆明系小鼠 雄性,体重18～22 g,生产许可证号:SCXK(辽)2014-004,由锦州医科大学实验动物中心提供;SPF级无菌鼠料 北京科奥协力饲料有限公司。

XSC型小鼠恒温游泳池 北正华生物仪器设备有限公司;3-18KS离心机 德国Sigma公司;ADVIA 2400型全自动生化分析仪 德国Bayer公司;JA5003A型精密电子天平 上海精天电子仪器有限公司;半自动切片机HS-3315 金华市华速科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑枸杞水提物的制备 黑枸杞水提取物的提取方法为浸渍法。称取黑枸杞50 g,放于装有1000 mL蒸馏水的烧杯中,于70 ℃恒温避光浸渍4 h后,过滤,将滤液用旋转蒸发仪在70 ℃下旋转蒸发回收溶剂过滤,将滤液定容到125 mL(终浓度为400 mg/mL)。然后将400 mg/mL的提取物配制成0.05、0.10、0.15 g/mL;放于4 ℃的冰箱中避光待用。

1.2.2 动物分组及给药 小鼠分笼饲养,5 只/笼,室温(22±2) ℃,相对湿度 50%±10%,噪音小于 60 dB,日光灯的明暗间隔为 12 h,自由饮食和饮水。适应性喂养一周后,将60只雄性ICR小鼠随机分安静对照组、空白对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组10只。在小鼠饲喂30 min后用灌胃针进行灌胃,灌胃药物及含量详见表1。阳性对照组灌服西洋参胶囊依参考文献[12]为500 mg/kg·bw(成年人每日摄入量10倍),换算为配制成0.05 g/mL,低、中、高剂量组分别换算为0.05、0.10、0.15 g/mL黑枸杞水提物,各组灌剂量均为0.1 mL/10 g体重。每3 d称重1次,以调整灌服剂量,每天早上(9:00～11:00)根据体重经口灌胃给药1次,每天除安静对照组外其余各组小鼠灌胃30 min后进行游泳训练,每5 d为1个周期,第一个周期游泳训练时间为5 min,每过一个周期游泳时间增加5 min,训练6个周期,安静对照组不参与游泳训练,各组小鼠在相同条件下进行常规饲养和管理。

1.2.3 小鼠体重测定 灌胃饲养前和末次灌胃后,分别称量各组小鼠的体重,并记录。

1.2.4 负重游泳时间测定 末次给药30 min后,在小鼠尾根部负以小鼠体重5%的铅皮,置于恒温游泳池中游泳,水深30 cm,水温(25±0.5) ℃,记录小鼠自游泳开始至力竭的时间(小鼠头部全部沉入水中8 s不抬头),即小鼠负重游泳时间。

1.2.5 小鼠抗疲劳血清生化指标的测定 小鼠负重力竭游泳后,休息1 d,并进行无负重游泳30 min,休息10 min后,眼球采血,离心,制备血清,备用。将采血后的小鼠立即取肝脏和股四头肌肉,经生理盐水漂洗后用滤纸吸干,保存,备用。按照试剂盒提供方法检测血乳酸(BLA)、血尿素氮(BUN)、血乳酸脱氢酶(LDH)及肝糖原(LG)、肌糖原(MG)水平。

1.2.6 组织形态学观察 将安静对照组小鼠处死,取安静对照组及各组部分心肌组织,浸于Bouin’s固定液固定48 h,制备常规石蜡切片,HE染色,于100×10显微镜下观察心肌组织结构。

1.3 统计学方法

2 结果与分析

2.1 黑枸杞水提物对小鼠体重的影响

由表1可知,与空白对照组相比,安静对照组、阳性对照组和低、中、高剂量组小鼠的体重均无显著差异(p>0.05),说明低、中、高剂量的黑枸杞水提物对小鼠的体重无显著的影响。

表1 黑枸杞水提物对小鼠体重的影响Table 1 The effect of aqueous extract from Lycium ruthenicum murr. on body weight of mice

2.2 黑枸杞水提物对小鼠负重游泳时间的影响

由表2可知,与空白对照组相比,阳性对照组、低、中、高剂量组第1、2、3、4周小鼠均能极显著的延长负重游泳时间(p<0.01);与阳性对照组相比,低剂量组第1、2、3、4周负重游泳时间差异亦均极显著(p<0.01),高剂量组除第一周差异不显著外,其他周差异均显著(p<0.05),中剂量组除第2周差异显著外,其他时间差异均不显著(p>0.05);而低、中、高剂量组间在第1～4周也均表现出差异的显著性(p<0.01,p<0.05),其中中剂量组的效果最佳。说明黑枸杞水提物对小鼠的疲劳有显著的拮抗作用,增强小鼠的抗疲劳性,中剂量组灌胃剂量的作用效果更好。

表2 黑枸杞水提物对小鼠负重游泳时间的影响(s,n=10)Table 2 The effect of aqueous extract from Lycium ruthenicum murr. on weight-loaded swimming time in mice(s,n=10)

2.3 黑枸杞水提物对小鼠血液生化指标的影响

由表3可知,与安静对照组相比,空白对照组血液中BLA和BUN的含量均有极显著提高(p<0.01),血液中LDH含量无统计学意义(p>0.05),说明力竭游泳运动可显著提高血液中BLA和BUN的水平增高,而对血液中LDH的水平没有明显的影响。

表3 黑枸杞水提物对小鼠血液生化指标的影响(n=10)Table 3 The effect of aqueous extract from Lycium ruthenicum murr. on contents of BLA,BUN and activity of LDH in mice after exercise(n=10)

与空白对照组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠血液中BLA和BUN水平均有不同程度的降低,BLA水平低剂量组差异显著(p<0.05),中、高剂量组差异极显著(p<0.01),BUN水平低、高剂量组差异显著(p<0.05),中剂量组差异极显著(p<0.01);低、中、高剂量组中小鼠血液中LDH的水平均有不同程度的提高,低、高剂量组差异显著(p<0.05),中剂量组差异极显著(p<0.01)。说明黑枸杞水提物能显著降低力竭小鼠血液中BLA和BUN的水平,提高LDH的水平,延缓疲劳的产生,其作用效果与灌喂的剂量有关,但不随剂量的增加而增强。与阳性对照相比,低、高剂量组小鼠血液中BLA和BUN的水平均显著增高(p<0.05),血液中的LDH的水平显著降低(p<0.05),中剂量组中各项指标差异均不显著(p>0.05);说明黑枸杞水提物对力竭小鼠的抗疲劳作用与西洋参胶囊作用基本一致,其中以中剂量组的剂量效果更佳。

由表4可知,与安静对照相比,空白对照组的肝糖原和肌糖原水平均极显著降低(p<0.01),说明力竭运动导致肝糖原和肌糖原过度消耗。与空白对照组相比,低、中、高剂量组小鼠肝糖原和糖原水平均有显著提高,低、高剂量组差异显著(p<0.05),中剂量组差异(p<0.01)极显著,说明黑枸杞水提物能显著增加力竭小鼠的肝糖原和肌糖原的储备,延缓疲劳的出现。与阳性对照组相比,低、高剂量组肝糖原和肌糖原的水平均显著降低,中剂量的肝糖原和肌糖原水平均无统计学意义,说明黑枸杞水提物与西洋参胶囊一样具有防止力竭小鼠肝糖原和肌糖原的过度降低,延缓疲劳的发生,提高机体的运动能力,且以中剂量组的剂量效果更佳。

表4 黑枸杞水提物对小鼠肝糖原 和肌糖原的影响(n=10)Table 4 The effect of aqueous extract from Lycium ruthenicum murr. on contents of MG and LG in mice after exercise(n=10)

2.4 黑枸杞水提物对小鼠抗心肌运动损伤的影响

如图1可知,安静对照组细胞核分布均匀,形态呈椭圆形,体积适中,细胞间隙适中。空白对照组细胞核分布不均匀,形态趋近线形,细胞间隙明显增大。阳性对照组细胞核分布均匀,形态呈椭圆形,细胞间隙小。低剂量组细胞核分布不均匀,形态趋近线形,细胞间隙增大。中剂量组细胞核分布均匀,形态呈椭圆形,体积适中,细胞间隙小。高剂量组细胞核分布不均匀,形态呈椭圆形或线形,胞间隙不均匀。说明黑枸杞水提物能改善心肌细胞间隙和心肌细胞的分布的均匀程度,提高心肌抗损伤能力。

图1 黑枸杞水提物对心肌细胞的影响Fig.1 Effect of aqueous extract from Lycium ruthenicum murr. on cardiac myocyte注:A:安静对照组;B:空白对照组;C:阳性对照组; D:低剂量组(0.05 g/mL);E:中剂量组(0.1 g/mL); F:高剂量组(0.15 g/mL)。

3 结论与讨论

运动耐力是评价机体疲劳的一个重要指标[13]。负重游泳时间的长短可以较好地反映动物运动抗疲劳程度。负重游泳运动导致全身的肌肉收缩,持续性肌肉收缩造成机体供氧不足而启动糖酵解路径提供能量,同时产生大量的乳酸,乳酸浓度增加使肌肉H+和无机磷堆积,导致肌肉组织内的pH下降,改变肌肉组织内环境,导致疲劳的产生[14]。而血液中的LDH可加速血液中乳酸分解清除,抑制了疲劳的产生或者加速疲劳的消除,因此,血乳酸和乳酸脱氢酶的水平是反应机体疲劳产生和消除速度的重要指标。尿素氮是蛋白质、氨基酸等物质分级代谢的产物,当机体长时间不能从糖类、脂肪的代谢中获得足够的能量时,蛋白质的分解代谢就会增强,进而提供机体所需的能量,同时产生更多的尿素氮,氨中毒可能影响中枢神经系统关键区域的持续协调活动[15]。所以,血清尿素氮含量是评价疲劳程度的另一个重要指标[16]。已有研究表明黑枸杞果实中的多糖、花青素等成分均具有抗疲劳作用,汪建红等[9]报道黑枸杞果实多糖能能延长小鼠的负重游泳时间,增强小鼠血清和肝脏的 SOD 活性,降低 MDA 的含量,提高肝糖原、肌糖原的储备量,降低小鼠运动后血清尿素和血乳酸水平。古丽达娜等[17]报道黑果枸杞色素对小鼠耐缺氧、抗疲劳游泳能力具有明显的增强作用。本研究表明低、中、高剂量组均能极显著的延长小鼠爬杆和负重游泳时间,对小鼠体重无显著的影响。能显著降低力竭小鼠血液中BLA和BUN的水平,提高血液中LDH的水平,其中以中剂量组的效果更为显著,说明黑枸杞水体物能提高小鼠血清中LDH水平,加速消除血液中乳酸的分解,降低乳酸的含量,同时,具有使小鼠运动后的血清尿素氮含量下降的功能,且与灌喂的剂量有关。这可能与黑枸杞水体物中的含有的多糖、青花素等成分具有抗疲劳的作用有关,关于黑枸杞水提物的有效成分及含量还有待于进一步研究。

分解脂肪和碳水化合物是骨骼肌运动过程中能量的主要来源,而糖原是能源生产的主要糖源[18]。运动能量最初来源于糖原分解,当剧烈运动导致肌糖原耗尽时,则能量会来源于肝糖原的释放[19];因此,血糖、肝糖原、肌糖原是反映耐受疲劳能力的重要指标。本研究表明黑枸杞水提物能不同程度地提高小鼠肝糖原和肌糖原的水平,其中中、高剂量组肝糖原和肌糖原水平差异显著。说明黑枸杞水体物能有效的提高小鼠的肝糖原和肌糖原的水平,为力竭小鼠提供能量储备,其主要原因可能是黑枸杞水提物中含有多糖、花色苷等营养物质,贮存在小鼠的肝脏和肌肉中,为机体提供了能源储备,延缓了蛋白质和氨基酸分解代谢,降低了血尿素氮水平,延缓了疲劳的产生。