马铃薯抗性淀粉的微波-湿热制备工艺优化及结构表征

刘 敏,韩育梅,何 君,黄 欢,王绍帆

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和和特 010018)

抗性淀粉(Resistant starch)被认为是一种能在结肠中部分或完全发酵的纤维组分,经过结肠微生物群的利用,能够形成短链脂肪酸等代谢产物,降低肠道pH,有益于肠道健康[1-2]。抗性淀粉大部分由老化/重结晶的短直链淀粉构成,可通过物理改性的方法制备。主要有以下几种方法:水热处理法、脱支处理法、微波处理法、挤压处理法、超声波处理法等[3-4]。

湿热处理(Heat-moisture treatment,HMT)制备抗性淀粉过程中,淀粉颗粒结构被破坏,部分分子链被解聚。处理前有选择的进行酸解或热解，可提高抗性淀粉得率[5]。Hung等[6]采用酸解-HMT法制备甘薯及山药抗性淀粉,实验结果表明,酸解-HMT较HMT法制备抗性淀粉得率更高,且两者结构之间存在明显差异。利用微波法对淀粉进行水解处理的报道较少。微波处理较传统的水热处理具有升温短、高效节能、操作简单、易于控制等优点。研究发现,微波效应在淀粉乳糊化的前期,可以显著影响淀粉颗粒内部水分分布,并能够促进该阶段淀粉的内氢键破坏,从而导致淀粉颗粒内双螺旋链减少,使淀粉更容易糊化[7]。

本实验通过微波-湿热法制备马铃薯抗性淀粉,研究微波处理对抗性淀粉得率及结构的影响,并利用正交实验进行参数优化,以期为微波-湿热法制备马铃薯抗性淀粉提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马铃薯精制淀粉 呼和浩特华欧淀粉有限公司;胃蛋白酶(≥3000 U/g) 上海金畔生物科技有限公司;耐高温α-淀粉酶(120 KNU/g) 诺维信生物技术有限公司;葡萄糖淀粉酶(10000 U/g) 北京生瑞太科技有限公司;其他试剂 均为分析纯。

MCR-3E常压微波合成萃取仪 功率范围:0～750 W,郑州世纪双科实验仪器有限公司;SX-500高压蒸汽灭菌锅 日本TOMY公司;SHZ-88-1水浴恒温振荡器 上海雅荣生化设备仪器有限公司;T6紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;PL303电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HC-3018离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;PB-10型pH计 赛多利斯科学仪器有限公司;GCX-9076数显鼓风干燥箱 上海启威电子有限公司;Phenom Pro扫描电子显微镜 复纳科学仪器(上海)有限公司;IRSffinity-1傅里叶变换红外分光光度计 日本岛津公司;Empyresn型X-射线粉末衍射仪 荷兰PANalytical公司。

1.2 实验方法

1.2.1 马铃薯抗性淀粉的制备与纯化 用蒸馏水将马铃薯淀粉(MY)制备成不同质量分数的淀粉乳,搅拌均匀后，用不同微波功率及微波时间对淀粉乳进行预处理,然后在120 ℃下湿热处理30 min,冷却至室温后，在4 ℃下静置24 h,置于60 ℃烘箱干燥36 h,粉碎并过80目筛,得到微波-湿热法处理的马铃薯抗性淀粉(WH)。

结合曹力心[8]、刘雷[9]、谢涛[10]等人的方法并做适当修改。将老化后的淀粉中加入pH为1.5的HCl-KCl缓冲溶液,然后加入过量(≥20 μL/g干抗性淀粉)胃蛋白酶,40 ℃水浴振荡1 h,冷却至室温;将乳液pH调至5.5～6.5,加入适量(≥50 μL/g干抗性淀粉)耐高温α-淀粉酶,95 ℃水浴振荡30 min,冷却至室温;将乳液pH调至4.0～4.5,加适量(≥50 μL/g干抗性淀粉)葡萄糖淀粉酶,60 ℃水浴振荡12 h,冷却至室温;在3000 r/min下离心30 min后,用95%乙醇洗涤，离心(3000 r/min,30 min)2～3次,再经干燥、粉碎、过80 目筛,得纯抗性淀粉。

1.2.2 单因素与正交实验 按照上述湿热、老化及干燥条件,以马铃薯抗性淀粉得率为考察指标,进行单因素实验。在微波功率750 W、淀粉乳质量分数20%条件下,考察微波时间(0、60、120、180、240 s)对抗性淀粉得率的影响;在微波时间180 s、淀粉乳质量分数20%条件下,考察微波功率(550、600、650、700、750 W)对抗性淀粉得率的影响;在微波时间180 s、微波功率750 W条件下,考察淀粉乳质量分数(5、10、15、20、25%)对抗性淀粉得率的影响。根据单因素实验结果,按表1进行正交实验。

表1 正交实验因素与水平

得率(%)=还原糖(%)×0.9

式中,C为还原糖量,mg;V为样品提取液体积,mL;W为样品重量,g;a为显色用样品液体积,mL。

1.2.4 扫描电镜、红外光谱和X-射线衍射 扫描电镜分析参考石海信[13]的方法,放大2000倍进行观察;红外光谱分析采用吴小婷[14]的方法;X-射线衍射分析按陈龙[15]的方法进行。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 微波时间对抗性淀粉得率的影响 微波时间对抗性淀粉得率的影响见图1。

图1 微波时间对抗性淀粉得率的影响

由图1可知,微波时间对马铃薯抗性淀粉得率的影响呈现先增大后减小的趋势。当微波时间为180 s时,马铃薯抗性淀粉得率达到最大，为8.69%。朱木林等[16]研究发现,微波作用时间显著(p<0.01)影响微波-酶法制备甘薯抗性淀粉的得率。探究其原因可能是:微波时间过短，会造成淀粉分子内氢键不能完全破坏,淀粉颗粒结晶结构完好,致使淀粉不能有效的糊化;微波时间过长,淀粉分子发生一定程度上的降解,导致直链淀粉形成的分子链偏小,不利于冷却老化过程中新结晶结构的产生[16-17]。对微波时间分别为0、180 s时的得率进行独立样本T检验,发现单独HMT(微波时间=0 s)与微波-HMT(微波时间=180 s)存在显著性差异(p=0.000<0.05),证明在HMT法制备马铃薯抗性淀粉前进行有效的微波处理是有利的。且适宜的微波时间为180 s。

2.1.2 微波功率对抗性淀粉得率的影响 微波功率对抗性淀粉得率的影响见图2。

图2 微波功率对抗性淀粉得率的影响

由图2可知,微波功率在550～750 W范围时,马铃薯抗性淀粉得率随着微波功率的增加而增大。当微波功率为750 W时,马铃薯抗性淀粉得率达到最大值9.14%。Zhang等[18]研究发现，在微波处理法制备芭蕉芋抗性淀粉过程中,微波功率对淀粉结构的影响显著(p<0.05),功率在400～1000 W范围内能够破坏淀粉结构，并增加直链淀粉的浸出程度。而直链淀粉得率与抗性淀粉得率呈现正相关关系,抗性淀粉得率会随着直链淀粉得率的增加而增大[19]。因此,微波功率选择为750 W。

2.1.3 淀粉乳质量分数对抗性淀粉得率的影响 淀粉乳质量分数对抗性淀粉得率的影响见图3。

图3 淀粉乳质量分数对抗性淀得率的影响

由图3可知,淀粉乳质量分数对马铃薯抗性淀粉得率的影响,呈现先升后降的趋势。在淀粉乳质量分数15%时,得率达到最高，为9.21%。抗性淀粉是由老化的短直链淀粉互相通过氢键结合而成,该阶段淀粉氢键的个数与淀粉乳体系中水分含量有关,随水分含量的增加呈现先增大后减小的趋势[20]。淀粉乳质量分数低,则表示体系中水分含量高,影响直链淀粉分子间氢键的生成,阻碍淀粉的老化回生,不利于抗性淀粉产生;淀粉乳质量分数高,意味着体系中水分含量低,黏度相对较大,淀粉分子不能够充分的膨胀糊化,致使直链淀粉不易相互靠近形成抗性淀粉[21]。因此,适宜的淀粉乳质量分数为15%。

2.2 正交实验优化

由表2可以看出,影响抗性淀粉得率的因素主次顺序为:C(淀粉乳质量分数)>A(微波时间)>B(微波功率);制备抗性淀粉的最优因素水平组合为:A3B3C2,即淀粉微波时间240 s、微波功率750 W、淀粉乳质量分数为15%。该实验组已在表2中出现,为第7组,所得抗性淀粉得率可达到9.77%。

表2 L9(33)正交实验设计与结果

由表3正交实验方差分析表可以看出,淀粉乳质量分数对马铃薯抗性淀粉得率的影响显著(p<0.05),而微波功率和微波时间对马铃薯抗性淀粉得率的影响不显著(p>0.05)。

表3 正交实验方差分析

2.3 颗粒形态分析、红外光谱分析及X-射线衍射分析

观察图4扫描电镜结果可知,马铃薯淀粉颗粒完整,整体呈现不规则椭圆形,表面较为光滑,颗粒直径约为20～80 μm;而经微波-湿热工艺处理的马铃薯淀粉,颗粒完整性被破坏,直径约为10～30 μm,多为不规则的碎石状,表面粗糙且有明显的层状起伏。导致这一结果的原因是:经微波-湿热法处理后马铃薯淀粉糊化,使颗粒结构吸水膨胀破裂,直链淀粉溶出,在老化阶段逐渐有序重排,形成稳定的晶体结构,因此抗性淀粉呈现为颗粒形态不规则和表面粗糙。研究发现,微波处理可以破坏支链淀粉晶体的层状排列,引起淀粉结晶区中的水分子振动,增强淀粉分子的破裂[22]。而湿热处理也会促进淀粉分子中心部位的结构发生重排或转移,并使围绕中心部位的分子链结晶度增大[23]。

图4 马铃薯淀粉(MY)及抗性淀粉(WH)扫描电镜照片(2000×)

由图5红外光谱可知,3408.22、3367.71 cm-1处为分子间氢键O-H伸缩振动吸收峰;2929.87 cm-1处为饱和C-H键的伸缩振动吸收峰;1644.53、1651.07 cm-1为碳水化合物中的COO-键的伸缩振动吸收峰;972.12、1082.07、1170.79、1002.98、1078.21、1155.36 cm-1为吡喃环的非对称伸缩振动吸收峰和连接伯、仲醇羟基的C-O键伸缩振动吸收峰;854.47、864.11 cm-1处为D-吡喃葡萄糖α吸收带[24-27]。抗性淀粉和马铃薯淀粉各主要特征峰基本重合,证明微波-湿热处理没有引入新的基团,微波-湿热处理为物理改性方法。

图5 马铃薯原淀粉(MY)及抗性淀粉(WH)红外光谱

与原淀粉相比,抗性淀粉在3367.71 cm-1处的吸收峰变得较为高窄,这是因为微波-湿热处理降解淀粉大分子链,改变分子间的氢键所形成的[14]。研究认为1047 cm-1处的吸收峰主要反映了淀粉中有序结构(结晶区)的振动吸收,1022 cm-1吸收峰则反映了淀粉中无序结构(非晶区)的振动吸收[28]。1047与1022 cm-1的吸收峰面积比值被称为强度比,可以反映淀粉颗粒的结晶程度[29]。马铃薯原淀粉的强度比(R=1047/1022 cm-1)为0.64,经微波-湿热处理后增加至0.75,这可能是由于微波-湿热工艺处理后破坏了淀粉的原结构,在老化过程中形成的新晶体,双螺旋结构平行排列更紧密所造成的[30]。

由图6及表4可以看出,马铃薯淀粉表现出典型的B型结晶结构,衍射角2θ在5.6、14.9、17.3、19.6、22.4、24.0 °出现衍射峰,这与Chang等人的研究结果相似。2θ角为5.6 °存在的特征峰(B型晶体的典型衍射峰)和2θ角22～24 °范围内存在的双肩峰也能够证实这一观点。经微波-湿热法制备的抗性淀粉的X-射线衍射图谱有所改变,2θ角为5.6 °时的特征峰值消失,且22.4、24.0 °处的衍射峰分别转移至21.5、23.6 °,这表示淀粉晶体由原来的B型晶体结构转变为C型结构,这种晶型的转变已有研究报道[32]。马铃薯淀粉的B型晶体结构,呈现左手双螺旋平行聚集,构成六方体形,中心部位充满36个结构水,而微波-HMT处理淀粉会使其脱水失去中心部位的36个水分子,并且一对双螺旋结构运动到最初由水分子占据的中心部位,导致了这种多晶型结构的形成[33-34]。Varatharajan[35]等研究发现,在HMT处理过程中,晶体的重新定向和/或晶体中较大的有序晶束的损失,导致了淀粉2θ角为5.5 °时的衍射峰会有所降低。由表4可知,淀粉的结晶度也发生了变化,由原淀粉的25.16%转变为29.09%,变化趋势与R1047/1022一致。

表4 R1047/1022、峰值强度和结晶度

图6 马铃薯淀粉(MY)及抗性淀粉(WH)X-射线衍射图

3 结论

微波-湿热法制备马铃薯抗性淀粉的最佳工艺参数为:微波时间240 s、微波功率750 W、淀粉乳质量分数15%。在此工艺条件下,马铃薯抗性淀粉得率为9.77%。淀粉乳质量分数对微波-湿热法制备马铃薯抗性淀粉的得率影响显著(p<0.050)。

马铃薯淀粉颗粒完整,表面光滑,整体呈现不规则椭圆形,而马铃薯抗性淀粉颗粒不完整,多为不规则的碎石状,表面粗糙且有明显的层状起伏;抗性淀粉和原淀粉的红外光谱图没有明显差异,主要特征吸收峰相似,但对比马铃薯淀粉,马铃薯抗性淀粉分子间氢键发生了变化,且R1047/1022从0.64增加至0.75;马铃薯淀粉结晶结构为B型,而马铃薯抗性淀粉结晶结构为C型,马铃薯淀粉和马铃薯抗性淀粉结晶度分别为25.16%、29.09%,变化趋势与R1047/1022一致。