抑制α-葡萄糖苷酶活性鹰嘴豆乳制备条件优化

瞿恒贤,李启明,黄玉军,陈 霞,印伯星,顾瑞霞,陈大卫，*

(1.扬州大学食品科学与工程学院,江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室,江苏扬州 225009;2.新希望乳业股份有限公司,四川成都 610000)

鹰嘴豆(Cicerarietinum),又名桃尔豆、鸡豆、鸡心豆等,起源于亚洲西部和中东地区。我国鹰嘴豆种植主要分布在新疆、甘肃等地,在新疆已有2500年应用历史[1]。鹰嘴豆作为一种古老的豆类植物,营养价值非常高,同时也具有较强的功能特性和特殊风味,是一种健康食品。鹰嘴豆中含有丰富的不饱和脂肪酸、大豆异黄酮和皂苷等多种生理活性物质,能改善糖尿病小鼠的血糖和血脂,其含有的异黄酮在降低血清甘油三酯方面的作用尤为突出[2-3]。凯赛尔·阿不都克热木等[4]研究发现,鹰嘴豆总皂苷对糖尿病大鼠血糖血脂具有调节作用。

α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidases)是淀粉水解酶类的一种[5],主要作用是通过水解α-1,4糖苷键,从淀粉和有关多糖的非还原端切下葡萄糖[6]。人体对淀粉、糊精、蔗糖等碳水化合物的吸收利用主要依赖于小肠刷状缘上该酶的活性[7]。抑制α-葡萄糖苷酶活性,可以减缓葡萄糖的生成和吸收,从而起到降低血糖的作用[8]。目前的研究也表明,α-葡萄糖苷酶抑制剂不仅对糖尿病和肥胖症具有预防作用,同时还兼备抗肿瘤和抗ADS病毒的能力[9-10]。因此,研究对α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有十分重要的意义。

随着鹰嘴豆的食用及保健价值逐渐认知,市场对鹰嘴豆产品的需求与日俱增。目前,鹰嘴豆食品主要有鹰嘴豆乳系列饮料、罐头食品、速溶食品、膨化食品等[11]。鹰嘴豆乳饮料的研究主要集中在简单的调配及稳定性的研究[12-14],对鹰嘴豆乳产品功能特性的强化却鲜有研究。在加工的过程中，加工工艺对鹰嘴豆中的活性成分具有一定的影响。本研究以α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，优化鹰嘴豆乳的酶解条件,使鹰嘴豆中的活性成分得以溶出,从而制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的鹰嘴豆乳。同时为了得到良好的稳定性,防止鹰嘴豆乳蛋白质的沉淀,以离心沉淀率为指标,通过单因素实验选择合适的稳定剂及浓度,并通过正交实验对稳定剂进行了复配,为开发功能性鹰嘴豆乳奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鹰嘴豆(蛋白质、脂肪、淀粉含量分别为22.50%、5.50%、50.00%) 新疆木垒县;α-淀粉酶(20000 U/mL)、糖化酶(100000 U/g)、α-葡萄糖苷酶(30000 U/g) 江苏锐阳生物技术有限公司;4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG) 美国Sigma公司;明胶、黄原胶、卡拉胶、海藻酸钠、果胶、瓜尔豆胶 上海昊岳实业有限公司;浓硫酸、盐酸、硼酸(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

1510型酶标仪、MACH1.6R型离心机 美国Thermo公司;HH-6型恒温水浴锅 国华电器有限公司;PL2002电子天平(1/100) 梅特勒-托利多仪器有限公司;UDK159全自动凯氏定氮仪 意大利VELP公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鹰嘴豆乳的制备 整体流程为:鹰嘴豆→筛选→清洗烘干→磨粉→浸泡→磨浆→过滤→糊化→液化→糖化→稳定剂调配→二次均质→杀菌。

筛选表面有光泽、无霉变、颗粒饱满的鹰嘴豆,清洗60 ℃烘干后磨粉浸泡,按一定料水比磨浆后100目筛过滤。制得的鹰嘴豆乳80 ℃糊化后,加入20000 U/mL的高温α-淀粉酶(终浓度7 kU/kg)95 ℃液化,再加入100000 U/g的糖化酶(终浓度200 kU/kg)60 ℃糖化。加入复配稳定剂,二次均质(21 MPa 65 ℃,5 MPa 65 ℃),并于75 ℃杀菌25 min。

1.2.2 鹰嘴豆粉浸泡与制浆条件的确定 浸泡条件:取1.2.1中所得鹰嘴豆粉,在常温下浸泡不同时间(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)后以料水比1∶8 (g/mL)磨浆,100目筛过滤,测定所制备鹰嘴豆乳的蛋白质含量和蛋白质得率。制浆条件:鹰嘴豆粉在常温下采用最佳浸泡时间浸泡并按1∶3、1∶4、1∶5、1∶8、1∶9、1∶10、1∶12 (g/mL)不同料水比制浆,100目筛过滤后,测定制备的鹰嘴豆乳的蛋白质含量和蛋白质得率。

1.2.3 鹰嘴豆乳酶解条件优化 糊化:取最佳浸泡条件和制浆条件制得的鹰嘴豆乳,80 ℃糊化60 min,每隔10 min取鹰嘴豆乳,测定其对α-葡萄糖苷酶的抑制率。液化:鹰嘴豆乳80 ℃糊化40 min后,按照1.2.1中条件液化60 min,每隔10 min取鹰嘴豆乳测定对α-葡萄糖苷酶的抑制率。糖化:鹰嘴豆乳80 ℃糊化40 min,95 ℃液化40 min后,降温至60 ℃,按照1.2.1条件糖化14h,每隔1～2h取鹰嘴豆乳测定对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.2.4 单一稳定剂对鹰嘴豆乳稳定性的影响 将瓜尔豆胶、黄原胶、果胶、卡拉胶和海藻酸钠这5种胶体,按照不同的添加量(0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.10%、0.30%、0.50%)单独加入到鹰嘴豆乳中,按1.2.1中方法均质、杀菌后放置24 h,以离心沉淀率为指标,比较其稳定效果。

1.2.5 稳定剂的复配 复配稳定剂效果往往高于单一稳定剂,因此本实验采取正交实验的方法进行复配,因素水平如表1所示。

表1 稳定剂复配因素水平表

1.2.6 蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮法[15]测定蛋白质含量,利用下式计算蛋白质得率:

蛋白质理论值=鹰嘴豆蛋白质含量×料水比

1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制率的测定 参考文献[16]中方法稍作改动。在600 μL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)中分别加入200 μLα-葡萄糖苷酶(0.2 U/mL)和100 μL鹰嘴豆乳;将混合物于37 ℃水浴10 min,再加入300 μL 20 mmol/L PNPG溶液,继续反应5 min;加入1 mL 1 mol/L Na2CO3作为反应终止液,于405 nm处测定其吸光值,计算α-葡萄糖苷酶抑制率。

式中,a为含有α-葡萄糖苷酶溶液但不含鹰嘴豆乳的吸光值;b为不含α-葡萄糖苷酶溶液及鹰嘴豆乳的吸光值;c为含有α-葡萄糖苷酶溶液及鹰嘴豆乳的测定吸光值;d为不含α-葡萄糖苷酶溶液但含鹰嘴豆乳的测定吸光值。

1.2.8 离心沉淀率的测定 取10 mL鹰嘴豆乳,离心(3000×g,30 min),弃上清,将离心管倒置30 min,称取沉淀物重量,利用下式计算离心率:

1.3 统计学方法

实验数据均平行测定三次,使用平均值±标准差表示,所有数据均采用SPSS进行统计分析,采用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 鹰嘴豆粉制浆条件的确定

2.1.1 鹰嘴豆粉浸泡条件的确定 不同浸泡时间后所得鹰嘴豆乳的蛋白质得率如图1所示。

图1 浸泡时间对鹰嘴豆乳蛋白质得率的影响

由图1可知,浸泡时间低于4 h时,蛋白质得率较低,低于90%,造成了蛋白质的浪费,不适合鹰嘴豆乳制品的工业化生产;当浸泡时间在7 h以上时,蛋白质得率显著升高(p<0.05),并趋于稳定,此时蛋白质得率达到96%以上。故最终选择7 h为最适的浸泡时间。

2.1.2 鹰嘴豆粉制浆条件的确定 不同料水比所得鹰嘴豆乳的蛋白质含量及蛋白质得率如图2所示。

图2 不同料水比对鹰嘴豆乳蛋白质含量及得率的影响

由图2可知,鹰嘴豆粉与水的料液比低于1∶5 (g/mL)时,蛋白质得率小于90%。当料水比大于1∶5 (g/mL)时,蛋白质的得率显著升高(p<0.05)。料水比达到1∶8 (g/mL)时,蛋白质得率趋于稳定。为了在保证蛋白质含量符合国家标准[17]规定的前提下,大大提高了鹰嘴豆乳蛋白质的得率,最终选用料水比1∶10 (g/mL)进行磨浆,此时蛋白质得率较高，达到97.89%,且豆乳的蛋白质含量为2.01%,符合国家标准。

2.2 鹰嘴豆乳酶解条件优化

为获取α-葡萄糖苷酶抑制率较高的鹰嘴豆乳,对鹰嘴豆乳糊化、液化、糖化时间进行了优化。

2.2.1 糊化时间对鹰嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影响 不同糊化时间处理后鹰嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率测定结果如图3所示。

图3 糊化时间对鹰嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

由图3可知,糊化时间为10 min时,α-葡萄糖苷酶抑制率仅为31.08%;随着时间的延长,α-葡萄糖苷酶抑制率呈逐渐上升趋势;糊化时间为40 min时,α-葡萄糖苷酶抑制率最高,为48.49%;糊化时间40 min后,α-葡萄糖苷酶抑制率显著下降(p<0.05)。故选用的最适糊化时间为40 min。

2.2.2 液化时间对鹰嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影响 不同液化时间处理后鹰嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率测定结果如图4所示。

图4 液化时间对鹰嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

由图4可知,液化时间为10～20 min时,α-葡萄糖苷酶抑制率无显著差异(p>0.05);液化时间30 min后,α-葡萄糖苷酶抑制率显著上升(p<0.05);液化时间为40 min时,达到最高,为65.48%;液化时间40 min后,α-葡萄糖苷酶抑制率显著下降(p<0.05)。故选择的最适液化时间为40 min。

2.2.3 糖化时间对鹰嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影响 不同糖化时间处理后鹰嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率测定结果如图5所示。

图5 糖化时间对鹰嘴豆乳α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

由图5可知,糖化前4 h,α-葡萄糖苷酶抑制率呈上升趋势;糖化时间为4～12 h时的α-葡萄糖苷酶抑制率最高,均在78%左右,各个时间点无显著性差异(p>0.05)。糖化时间12 h后,α-葡萄糖苷酶抑制率显著下降(p<0.05)。为保证水解完全且尽量缩短反应时间,故选择的最适的糖化时间为6 h。

鹰嘴豆乳80 ℃糊化40 min,95 ℃液化40 min,60 ℃糖化6 h后,对α-葡萄糖苷酶抑制作用最佳。这可能是因为,鹰嘴豆中的α-葡萄糖苷酶抑制剂(如糖蛋白)经酶解后得到充分释放,淀粉等大分子成分降解,鹰嘴豆中含有的活性成分如黄酮、皂苷、多糖等活性成分得以充分溶出,使得α-葡萄糖苷酶抑制率升高[18-21]。但鹰嘴豆乳在糊化40 min、液化40 min和糖化10 h后继续水解,α-葡萄糖苷酶抑制率逐渐下降,这可能是因为,随着时间的延长,鹰嘴豆乳的活性成分逐渐分解并且含量下降,造成其活性功能的降低[22]。

2.3 单一稳定剂对鹰嘴豆乳稳定性的影响

单一稳定剂不同添加量对鹰嘴豆乳离心沉淀率的影响如图6所示。

图6 单一稳定剂添加量对对鹰嘴豆乳离心沉淀率的影响

由图6A可知,当瓜尔豆胶添加量小于0.03%时,鹰嘴豆乳的离心沉淀率呈升高趋势;随着瓜尔豆胶添加量的增加,离心沉淀率降低;瓜尔豆胶添加量为0.1%时,离心沉淀率最低,为19.23%;瓜尔豆胶添加量超过0.1%以后,离心沉淀率显著升高(p<0.05)。故选择0.1%为瓜尔豆胶最适添加量。

由图6B可知,当鹰嘴豆乳中黄原胶添加量为0～0.1%时,离心沉淀率先升高后缓慢降低;在黄原胶添加量为0.1%时,离心沉淀率最低,为20.43%;黄原胶添加量大于0.1%时,离心沉淀率显著升高(p<0.05)。故最终选择0.1%为黄原胶最适添加量。

由图6D可知,在卡拉胶添加量小于0.01%时,鹰嘴豆乳的离心沉淀率呈升高趋势;卡拉胶添加量在0.01%～0.1%范围内时,随着添加量的增大,离心沉淀率显著降低(p<0.05);当卡拉胶添加量为0.1%时,离心沉淀率最小,为19.87%;卡拉胶添加量大于0.1%时,离心沉淀率显著升高(p<0.05)。故最终选择0.1%为卡拉胶最适添加量。

由图6C、6E可知,在鹰嘴豆乳中分别添加果胶和海藻酸钠以后,当果胶和海藻酸钠的添加量为0.01%时,离心沉淀率分别为20.70%和21.40%,均高于不添加稳定剂时的离心沉淀率,且随着添加量的增大,离心沉淀率不断增大,故海藻酸钠和果胶对鹰嘴豆乳的稳定性均无明显效果。

当瓜尔豆胶、卡拉胶、黄原胶添加量分别小于0.03%、0.01%、0.01%添加量时,离心沉淀率反而升高,这可能是因为,加入的瓜尔豆胶、卡拉胶与黄原胶未达到一定的浓度,产生了絮凝现象,促进了聚集的发生,使得离心沉淀率升高[23]。而在瓜尔豆胶、卡拉胶及黄原胶添加量超过0.1%后,离心沉淀率不同程度的增长,可能是因为添加量过高导致粘度过大,产品变粘稠,导致离心率的增加,此时的离心沉淀率并不能准确反映产品的稳定性[24]。此外,产品变得粘稠糊口，也会影响到饮料的整体口感。

2.4 复配稳定剂对应对豆乳稳定性的影响

在单一稳定剂实验的基础上,选择瓜尔豆胶、卡拉胶、黄原胶为实验因素,以离心沉淀率为考察指标,采取正交实验的方法进行复配实验，结果见表2。

表2 正交实验结果

由极差分析看出,RB>RA>RC,卡拉胶添加量对鹰嘴豆乳稳定性的影响最大,瓜尔豆胶次之,黄原胶最小。复配稳定剂的最佳配方为A1B3C2,即瓜尔豆胶添加量0.08%,卡拉胶添加量0.10%,黄原胶添加量 0.08%,此时测得产品的离心沉淀率为18.86%。

3 结论

本研究通过先磨粉后浸泡的方式,确定了鹰嘴豆粉浸泡与制浆的条件:浸泡时间为7 h,料水比1∶10 (g/mL),此时鹰嘴豆乳蛋白质的得率为97.89%。在保证蛋白质含量符合国家标准[17]规定的前提下,大大提高了鹰嘴豆乳蛋白质的得率。为得到对α-葡萄糖苷酶具有较高抑制作用的鹰嘴豆乳,以α-葡萄糖苷酶抑制率为指标,研究了糊化、液化、糖化条件对α-葡萄糖苷酶抑制作用的变化,结果表明,鹰嘴豆乳80 ℃糊化40 min,95 ℃液化40 min,60 ℃糖化6 h后,对α-葡萄糖苷酶抑制作用最高,抑制率达78.08%。

同时,采用复配稳定剂保证鹰嘴豆乳产品的稳定性。单因素实验结果表明,瓜尔豆胶、卡拉胶和黄原胶能够提高鹰嘴豆乳的稳定性。正交实验结果表明,卡拉胶、瓜尔豆胶、黄原胶添加量分别为0.10%、0.08%、0.08%时,鹰嘴豆乳的稳定性好,风味独特,口感柔和,且依然保持较高的α-葡萄糖苷酶抑制率,此时鹰嘴豆乳稳定性最高,离心沉淀率为18.86%。