超氧化物歧化酶对复发性阿弗他溃疡家兔T细胞亚群水平变化的影响

甘成文 邓 伟 廖天安 张 熹 冯冬婵 王 涛

(海南省人民医院口腔颌面外科，海南 海口 570311)

复发性阿弗他溃疡(RAU)见于口腔黏膜几乎所有部位，发病率高且易反复发作，病程周期长常伴有明显灼痛感〔1〕。引起RAU的因素包括：基因决定的遗传因素、环境因素、免疫力低下、感染、溃疡等消化系统疾病等，但其具体致病机制尚不明确，但是氧自由基的增多被广泛认为是导致RAU频繁发作的主要原因之一〔2，3〕。超氧化物歧化酶(SOD)是一种生物活性物质是重要的抗氧化酶之一，也是生物体内清除自由基的首要物质，可有效清除体内自由基等保护机体免受伤害。本研究通过动物实验探讨SOD对家兔T细胞亚群水平的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物与主要试剂、仪器 雄性普通级家兔30只，体重1.5～2.0 kg，单笼饲养，自由饮水，室温(20±2)℃，相对平均湿度45%，实验室适应性喂养1 w，采用随机数字表法分为空白对照组、阳性对照组和SOD组各10只。流式细胞仪：CytoFLEX型，贝克曼公司；病理切片机：CUT4062型，德国SLEE公司；匀浆机：T10型，德国IKA公司；乙醚：德音化工；甲基紫精：上海如吉生物科技发展有限公司；SOD生物胶囊：EP1317，福建华灿生物科技有限公司；白细胞介素(ILs)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒：上海恒远生物科技有限公司；血细胞裂解液：上海嵘崴达实业有限公司。

1.2RAU模型建立 在室温20～22℃取家兔兔板固定，乙醚麻醉，止血钳分开其上下颌，钢平尺镊轻轻抻拉出家兔的右侧颊囊部，然后选用5号皮试注射器，准确地均匀扇形注射约0.25 ml甲基紫精溶液，于右侧颊囊部位黏膜下层大约0.8 cm处缓慢推入。24 h后在注射部位黏膜可见溃疡形成。待家兔在口腔黏膜反复多次出现规则圆形或椭圆形的边缘整齐且表面覆有灰黄色假膜的溃疡，镜下组织病理表现为溃疡表面覆盖有大量坏死组织和炎性的渗出物，溃疡基底部毛细血管扩张，同时伴有中性、淋巴及单核细胞浸润，可确定为模型建立完成〔4,5〕，纳入阳性对照组和SOD组。

1.3给药方法 SOD组每天进行SOD生物胶囊溶液灌胃，阳性对照组和空白对照组给予蒸馏水灌胃，药物剂量1 g/次，频率3次/d，连续2 w〔4〕。

1.4组织病理学观察 模型建立完成2 d后，取阳性对照组和SOD组口腔溃疡病变组织；灌胃 7 d后，取阳性对照组和SOD组口腔溃疡病变组织，经过HE染色后镜下进行组织学检查。空白对照组取相应位置口腔黏膜组织进行组织学检查。

1.5流式细胞仪检测 将CD4+/CD8+免洗试剂加入到绝对计数管中，再加抗凝血试剂室温避光孵育15 min，再加血细胞裂解液室温孵育15 min，进行流式细胞仪软件分析检测。

1.6ELISA检测 各组血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6和IL-8检测，在分别取实验进行前，模型建立完成时及灌胃结束时，SOD组、阳性对照组及空白对照组耳缘静脉血4 ml，以口腔黏膜组织匀浆液作为抗原，来检测血清中抗口腔黏膜组织匀浆液的抗体〔6，7〕。按ELISA试剂盒使用说明严格操作。

1.7统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行方差分析，LSD检验。

2 结 果

2.1组织病理学观察 空白对照组黏膜上皮连续完整，固有层结缔组织致密，黏膜下层较厚可见小涎腺体；阳性对照组黏膜表面有断裂，覆盖假膜，并且有密集淋巴细胞、固有层有大量单核细胞及炎症细胞，毛细血管存在充血性扩张，血管内皮细胞呈肿胀状，且可见坏死区域；SOD组各个溃疡面表现为愈合状态，上皮可见完整且增厚组织，黏膜下有松散的结缔组织存在，并且有新鲜毛细血管。见图1。

图1 各组口腔黏膜组织HE染色(×400)

2.2各组外周血T淋巴细胞亚群比较 空白对照组CD4+T淋巴细胞及CD4+/CD8+比值均明显高于阳性对照组和SOD组，而CD8+T淋巴细胞明显少于阳性对照组和SOD组(P<0.05)；SOD组CD4+T淋巴细胞和CD4+/CD8+比值较阳性对照组显著升高，而CD8+T淋巴细胞较阳性对照组显著下降(P<0.05)。见表1。

2.3各组血清TNF-α、IL-1及IL-2比较 空白对照组TNF-α、IL-6和IL-8均明显低于阳性对照组和SOD组(P<0.05)；SOD组TNF-α、IL-6和IL-8较阳性对照组显著降低(P<0.05)。见表2。

表1 各组外周血T淋巴细胞亚群比较

与空白对照组比较：1)P<0.05；与阳性对照组比较：2)P<0.05；表2同

表2 各组外周血TNF-α、IL-6和IL-8比较

3 讨 论

RAU发生是多种因素共同作用的结果，患者免疫功能降低或亢进等免疫功能异常，基因决定的遗传基础，胃溃疡、十二指肠溃疡等消化系统疾病，其他疾病合并的感染及心理压力、工作生活环境等环境因素都会引起发作，研究证实〔6～8〕，除上述因素外还有其他原因可导致RAU发生，生物体体内氧自由基的增多可导致其频繁发作〔9〕。自由基是带电荷的原子或原子团〔10〕，动物体内以氧自由基存在为主包括：超氧阴离子自由基(O2-)、羟基自由基(-OH)和过氧化氢(H2O2)，氧自由基活性极强容易参与反应抢夺电子，紫外辐射、添加剂、环境污染等外部因素及新陈代谢均会产生氧自由基〔11〕。正常生理状态下，氧自由基的清除与产生保持动态平衡，病变时氧自由基不能被及时清除，可与周围组织的大分子抢夺电子，破坏细胞膜、内质网、溶酶体、DNA和RNA〔12〕，胶原蛋白变性使病变部位交联，致使组织发生病理改变，引起细胞损伤、衰老、非正常死亡甚至癌变〔13,14〕。SOD是生物体内一种生物活性物质也是重要的抗氧化酶，可清除生物体新陈代谢过程中产生的有害物质，最为重要的是它可清除氧自由基，起到保护机体的作用〔15〕。