SAMP8海马CA1区突触素表达及针刺的干预作用

阚伯红 王 煜 王一婧 高 青 赵 岚 兰 福 范英昌

(天津中医药大学第一附属医院针灸研究所 天津市针灸学重点实验室，天津 300381)

ExpressionofsynaptophysininSAMP8hippocampalCA1regionandtheinterventionofacupuncture

KANBo-Hong,WANGYu,WANGYi-Jing,etal.

FirstTeachingHospitalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,TianjinKeyLaboratoryofAcupunctureandMoxibustion，Tianjin300381,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of synaptophysin in Alzheimer′s disease(AD) model mice SAMP8 hippocampus and the effect of acupuncture on them.MethodsThirty SAMP8 mice were randomly divided into model (P8) and acupuncture groups, senescence-accelerated mouse resistance (SAMR) 1 as normal control (R1) group. The morphology changes of hippocampal CA1 pyramidal cells were observed by HE staining, and the expression of synaptophysin in hippocampal was evaluated by real-time PCR and immunohistochemistry(P<0.05).ResultsThe morphology and structure of pyramidal cells in SAMP8 hippocampus CA1 region were significantly damaged, and acupuncture had good effect on them. The expression of synaptophysin in SAMP8 hippocampus CA1 region was decreased significantly compared with that of SAMR1, and acupuncture increased the expression of synaptophysin.ConclusionsThe hippocampal synapses in SAMP8 mice are damaged and acupuncture has therapeutic effects on them by improving the expression of protein and gene of synaptophysin.

【Keywords】 Acupuncture; Alzheimer′s disease; SAMP8; Synaptophysin

阿尔茨海默病(AD)是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为进行性记忆缺损、认知损害和定向力障碍等，严重威胁老年人的身心健康。伴随我国人口老龄化加剧，AD给家庭和社会造成沉重的经济负担，成为制约社会发展的重要因素。AD属突触障碍性疾病范畴〔1〕。突触素(SYP)是特异性存在于突触前囊泡膜表面上的一种蛋白质，其密度间接反映突触的数量、分布和密度〔2〕。过去研究表明，三焦针法可明显改善AD的临床症状〔3〕，但其作用机制有待进一步研究，尤其是对突触的影响。

1 材料和方法

1.1主要试剂 mRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和SuperReal荧光定量预混试剂盒，均购自天根生化科技有限公司。引物由华大科技合成，SYP上游引物(AGTGCCCTCAACATCGAAGTC)，下游引物(CGAGGAGGAGTAGTCACCAAC)；内参为GAPDH，上游引物(AGGTCGGTGTGAACGGATTTG)，下游引物(TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA)。兔抗小鼠多克隆抗体SYP购自美国Abcam公司。即用型链霉亲合素-生物素复合物(SABC)过氧化物酶试剂盒(SC1022)、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(AR1022)、防脱玻片和封闭用正常兔血清，均购自武汉博士德公司。多聚甲醛、甲醛、水合氯醛、二甲苯、无水乙醇、伊红和苏木素等均为国产分析纯级。

1.2主要仪器 微量生物分光光度计(DeNovix，DS-Ⅱ，美国)，梯度PCR仪(ABI，ProFlex，美国)，实时定量PCR仪(Roch，LightCycler@ 96，瑞士)，万分之一天平(梅特勒-托利多，AE200，德国)，自动脱水机(Leica，TP1020，德国)，自动包埋机(Leica，EG1150H，德国)，自动切片机(Leica，RM2555，德国)，摊片机(Leica，HI1210，德国)，光学显微镜(Leica，DM3000，德国)，LAS图像分析系统(Leica，4.0，德国)，恒流泵、恒温箱、冰箱和微波炉均为国产。

1.3实验动物分组及处理 以8月龄快速老化小鼠(SAMP8)为模型对照组(P8组)，以同月龄抗快速老化小鼠(SAMR1)为正常对照(R1组)，治疗组(针刺组)对SAMP8给予三焦针法进行干预〔4〕，其余各组行相同程度的捉抓210 s。

1.4取材、提取总RNA、逆转录和定量PCR 将小鼠麻醉后脱臼处死，取得海马组织CA1区组织，放入无RNA酶的EP管中，加入裂解液，以研磨棒研磨，按照试剂说明书提取总RNA，测得RNA浓度，按照逆转录说明书合成第一链，每20 μl反应体系加入RNA 1.25 μg，模板1 μl，引物的终浓度为0.5 μmol/L，退火温度60℃，其他参照说明书。

1.5脑组织切片制作 小鼠脑组织灌注方法参照李灵芝等〔5〕报道，对进针深度略作改动，有落空感时停止进针，其他步骤不变。用0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB)(pH7.4)充分冲洗，修块，取含海马的脑组织，常规脱水、透明和浸蜡，石蜡包埋，用莱卡全自动切片机连续冠状切片，片厚5 μm。贴于预先防脱处理的载玻片上，于60℃烤片30 min，行HE和免疫组织化学染色。

1.6HE染色步骤 切片常规用二甲苯脱蜡，经梯度乙醇脱水至水化。苏木素染色，盐酸乙醇分化，温水冲洗，伊红染色后常规脱水，透明，封片。

1.7SABC法免疫组化 切片常规脱蜡至水；3%H2O2孵育10 min，以封闭内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗3次，每次2 min；流水冲洗5 min；1/100枸橼酸钠溶液、高压2 min抗原修复。冷却后0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗1～2次，每次2 min；用兔抗血清50 μl封闭，湿盒内室温封闭45 min；倾去封闭液(不洗)，滴加兔抗SYP(1∶1 000)50 μl，于湿盒内4℃过夜(约12 h)；复温30 min，0.02 mol/L PBS洗洗3次，每次2 min；滴加生物素标记的山羊抗兔IgG 50 μl，湿盒内孵育45 min；0.02 mol/L PBS洗3次，每次2 min；滴加试剂SABC50 μl，湿盒内室温孵育20 min；0.02 mol/L PBS洗4次，每次5 min；DAB镜下控制显色；自来水冲洗10 min；其余步骤同HE染色。

1.8图像分析 在海马CA1区域内，每只小鼠取3张切片于20倍物镜下随机选取5个视域，以LAS4.0软件系统摄像并进行分析，测量SYP阳性反应物的平均光密度值，每张切片的5个视野取其平均值，对每组切片的平均光密度值进行统计分析。

1.9统计学分析 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1形态学观察 R1组海马CA1区锥体细胞排列紧密，形态规则，结构完整，有大量的神经纤维发出；P8组锥体细胞排列松散，形状欠规则，结构不完整，神经纤维不明显；针刺组略有改善。见图1。

图1 各组海马CA1区HE染色结果(×200)

2.2海马CA1区SYP的表达变化及针刺干预作用 SYP免疫反应产物呈棕黄色，主要位于海马 CA1 区的神经毡区，呈颗粒状或点状免疫标记，神经元胞体、胶质细胞及血管不被标记，海马以多形层和辐射层染色较深。R1组海马 CA1 区染色较深，P8组颜色变淡，针刺组较R1组颜色明显加深。见图2。

R1组SYP阳性反应物的平均光密度值(2 719.00±962.22)明显大于P8组(14.48±6.95)，两组比较差异有统计学意义(P=0.001)；针刺组SYP阳性反应物的平均光密度值(1 714.23±784.44)大于P8组，差异有统计学意义(P=0.012)，但仍小于R1组。

图2 各组小鼠海马CA1区细胞形态及免疫组化染色(×200)

SYP mRNA含量反映各组中该基因在转录水平的变化。经统计学分析，各组数据呈正态分布，方差同质，两两间差异显著(P=0.000)，与R1组(设为1)相比，P8组SYP mRNA表达量(0.32±0.04)明显降低(P=0.000)，针刺对其有正向调节作用(0.41±0.039，P=0.035)，但其表达量仍低于R1组(P=0.000)。

3 讨 论

海马是大脑边缘系统的一个重要组成部分，在信息处理中起重要作用，是学习记忆的重要结构，其中海马CA1区锥体细胞的易损性在认知损伤的发生中起重要作用〔6〕。SAMP8中CA1区锥体细胞数量明显减少〔7〕，突触超微结构受损〔8〕。突触是神经元间信息传递的连接点，传递脑中的化学信号或电信号，对于学习记忆至关重要。研究发现，认知功能障碍的早期表现主要包括突触丢失和突触功能异常〔9〕。

SYP是一种与突触功能和结构密切相关的突触囊泡蛋白，参与了突触囊泡的导入及转运、神经递质释放和突触囊泡再循环过程，是突触发生和重塑的重要标志，可通过了解SYP的定位和定量反映突触的分布及功能状况。在神经遭受损伤后功能逐渐恢复的过程中，SYP的表达量在一定程度上可较好地反映突触再生和重塑的能力。AD 病人认知功能下降程度与海马及相关皮层SYP的改变有很好的相关性〔10〕。基因芯片研究表明轻度认知障碍(MCI)和AD患者海马CA1区突触基因(21/28)明显降低(其中包括SYP)，而轻度认知障碍和AD中转录水平无明显差异〔6〕。Callahan等〔11〕发现SYP蛋白的丢失量与神经元的神经原纤维缠结呈正相关。许丹等〔12〕发现SYP表达量随增龄而减低，且AD患者CA3区的表达量低于同龄人。Masliah 等〔13〕报道SYP免疫反应性在MCI或轻度AD 病人的皮层下降25%，在中度、重度病人的皮层进一步下降。柴继侠等〔14〕利用Western印迹法检测APP/PS1转基因小鼠海马内drebrin和SYP蛋白表达，发现SYP在AD后期起作用。

SAMP8是研究AD的较理想的动物模型，自发快速老化和生存期变短，具有AD典型的病理改变，与SAMR1相比，早在4月龄时就发生认知功能损伤，5月龄时皮层神经元减少和TAU蛋白过度磷酸化，6月龄时海马树突棘开始减少和β淀粉样蛋白(Aβ)沉积明显增加，8月龄时海马CA1区锥体细胞的数量明显降低〔15〕。本文选择的SAMP8相当于中、重度AD患者，采用免疫组织化学方法检测了SYP在海马区域的分布和含量，发现SYP主要位于海马CA1区的神经毡区，SAMP8海马CA1区SYP的表达量明显降低，同上述结果相似。

针刺作为祖国传统医学的重要组成部分，在治疗神经系统疾病中发挥了重要作用，且具备很好的安全性。针刺可以促进SAMP8突触超微结构和受体的改变〔16〕。针刺加康复可以增加局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠海马CA3区SYP的表达，促进中枢神经系统的重塑〔17〕。针刺可提高SYP的表达和促进脑瘫鼠的运动功能恢复〔18〕。“三焦”针法是韩景献教授基于“三焦气化失司导致痴呆”的病机理论所设，注重调节三焦涵盖的脏腑功能，充分体现了中医的整体观〔19〕。过去研究表明该针法可增加多种神经生长因子的水平，改善脑内微环境〔20〕。本研究发现该针法可增加SAMP8海马CA1区SYP的基因和蛋白表达，从而改善锥体神经的形态。

本研究为针刺治疗AD提供了理论和实验依据，同时为AD的治疗提供了一种选择。