相伟芳,李 敏,林艳平,王 静,张新玥,郭美琪,杨艺新,朱耿平,潘丽娜*
1天津师范大学生命科学学院,天津 300387;2天津市动植物抗性重点实验室,天津 300387;3漯河市豫中南林业有害生物天敌繁育研究中心,河南 漯河 462300
嗅觉是昆虫至关重要的感觉系统,昆虫利用嗅觉系统辨别其偏好的气味成分,继而引起特定的生理和行为反应,如定位寄主、探求配偶、交配、产卵、躲避天敌等(Webster & Cardé,2016)。通过研究昆虫嗅觉机制,将为调控昆虫行为、防控害虫侵袭、保护和利用有益昆虫奠定基础。近30年来,人们对昆虫嗅觉分子机制的有了相对深入的了解,主要过程可以概括为气味分子可以通过昆虫的嗅觉感器(sensillum)进入感器淋巴液中,与其中的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)结合并将其传递给气味受体(odorant receptors,ORs)。气味受体在接受气味分子后引起机体产生一系列的嗅觉反应(Vogt & Riddiford,1981)。由于OBPs对气味分子的选择具有相对的专一性,每一种OBP只能结合一定类别的气味分子,对气味分子起到初步的过滤作用,是昆虫嗅觉识别过程中非常关键的一步(Cuietal.,2016; Leal,2013)。因此,OBPs与气味分子的结合特性是本领域的研究热点,而分子对接技术(molecular docking)是近年来被应用于研究OBPs功能的新兴技术(Lietal.,2017)。
分子对接是根据Fisher于1894年提出的的理论模型“锁—钥原理”(lock and key principle)来模拟小分子配体与大分子受体间相互作用的一种方法。配体与受体的作用是分子识别的过程,主要通过氢键作用、疏水作用及范德华力等结合。通过计算,可以预测两者间结合的亲和力和结合模式,从而可以筛选出与大分子受体结合的小分子配体(Georgeetal.,2014)。由于可以实现快速精准对接,很大程度上减少配体小分子的筛选数量及时间,提高筛选效率和准确性。目前,分子对接技术已经被应用于多个领域,如生物大分子的修饰和药物设计等(许先进和王存新,1989)。2010年,分子对接技术开始应用于昆虫嗅觉机制领域(Heetal.,2010)。此后,该技术在此领域得到了广泛的应用,如Zhangetal.(2018)对茶尺蠖EctropisobliquaWarren气味结合蛋白OBP2、Wangetal.(2017)对紫榆叶甲AmbrostomaquadriimpressumMotsch气味结合蛋白AquaOBP4、Sunetal.(2017)对苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus(Goeze)气味结合蛋白OBP6的结合特性均进行了研究。
美国白蛾Hyphantriacunea(Drury)是重大外来入侵害虫,属鳞翅目灯蛾科,是一种食性杂、繁殖量大、适应性强、传播途径广、危害严重的世界性检疫害虫(季荣等,2003; 杨忠歧和张永安,2007;张向欣和王正军,2009)。1979年首次在我国辽宁丹东发现,随后扩散至山东、陕西、河北、天津等地,对我国农林业造成了严重危害(黄顶成和张润志,2011; 杨忠岐和张永安2007)。杨忠岐(1989)在我国发现和筛选出了寄生美国白蛾的特优天敌——白蛾周氏啮小蜂ChouioiacuneaYang。白蛾周氏啮小蜂属姬小蜂科啮小蜂属,寄生在美国白蛾的蛹中,对美国白蛾种群起到很好的控制作用(杨忠岐等,2005;郑雅楠等,2012)。目前已经广泛应用于美国白蛾的防治中,并取得显著成效。
本课题组前期对美国白蛾蛹、虫粪和老熟幼虫所释放的挥发性化合物进行了测定,共检测出了11种物质(Zhuetal.,2016);Zhaoetal.(2016)通过转录组测序技术对雌雄白蛾周氏啮小蜂触角进行了测序,共测定出25个气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、80个气味受体(odorant receptors,ORs)、10个离子受体(ionotropic receptors,IRs)、11个化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、1个神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPs)和17个味觉受体(gustatory receptors,GRs);王凤竹等(2017)、张新玥等(2018)通过实时荧光定量PCR检测及RT-PCR检测发现了一些主要在雌雄触角上大量表达的蛋白,推测这些蛋白的功能可能直接与寻找寄主相关,对白蛾周氏啮小蜂CcOBP1和非典型性气味受体CcOr83b基因进行了多角度的进化分析。本研究拟选取一个主要在雌性触角大量表达的蛋白CcOBP1,通过分子对接技术,研究与11种寄主挥发物的结合特性,从而确定CcOBP1的功能,为白蛾周氏啮小蜂的嗅觉分子机制研究积累数据。
根据已经得到的白蛾周氏啮小蜂CcOBP1全序列,通过BioEdit将序列转化成氨基酸序列作为建模模板,在Swiss-Model(http:∥swissmodel.expasy.org/)对CcOBP1进行同源建模,获得该蛋白的三维结构。用Ramachandran图(Ramachandranetal.,1963)评价CcOBP1蛋白三维结构的质量。
前期对美国白蛾蛹、老熟幼虫及虫粪的挥发物进行了鉴定,一共得到了11种化合物(表1)。将这11种化合物用于CcOBP1分子对接,从Pubchem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载这11种小分子的三维结构。用Schrodinger Suites 2015-2中的maestro 10.2软件进行分子对接:通过maestro 10.2软件导入已构建好的白蛾周氏啮小蜂OBP1的三维结构,用Discovery Studio 4.5 Visualizer软件打开该三维结构,手动输入具体坐标,可进行适当调整,使白蛾周氏啮小蜂OBP1的活性中心位于盒子中心,生成文件保存;导入已经下载好的小分子物质结构,进行小分子其他构象的搜索,保存生成的文件;用maestro 10.2进行分子对接,Pymol v1.3显示对接结果。
表1 小分子物质的名称及CAS号Table 1 Names and CAS numbers of small molecular substances
利用Swiss-Model在线搜素白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP1最佳模型的模板,结果表明,意大利蜜蜂Apismellifera的气味结合蛋白OBP14(Spinellietal.,2012)(ID:3s0g.1)的相似度最高,因此将意大利蜜蜂的气味结合蛋白OBP14作为白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP1的模板,通过Swiss-Model构建白蛾周氏啮小蜂CcOBP1结构模型(图1)。白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP1的三维结构包括Pro20-Asn36(α1)、Ala4154-Arg48(α2)、Asp61-Lys70(α3)、Glu82-Lys88(α4)、Leu93-Ala105(α5)、Ser112-Ala116(α6),6个α螺旋结构。
拉式构象(ramachandran)图结果显示,90.6%CcOBP1氨基酸残基落在最佳区域,8.5%的氨基酸残基落在较合理区域,只有0.9%的氨基酸残基落在不允许区域(图2)。有90.6%CcOBP1氨基酸残基落在最佳区域,大于90%,说明这个蛋白模型较为合理,可以用于后续的分子对接中。
图1 白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白Cc OBP1结构图Fig.1 3D structures of odorant binding protein1 of C.cuneaA:CcOBP1与意大利蜜蜂的气味结合蛋白OBP14(ID:3s0g.1)的序列比对,完全相同的残基以红色字体、黄色背景突出;B:白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP1三维结构图。A:Sequence alignment of CcOBP1 with OBP14 from A.mellifera (PDB ID:3S0g.1); α-helices are displayed as helix.Strictly identical residues are highlighted in red letters with yellow background; B:The 3D structures of CcOBP1.
图2 白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP1Ramachandran图Fig.2 Rational evaluation of the established 3D model of CcOBP1 by Ramachandran plot蓝色区域表示氨基酸残基位于最佳区域(90.6%),紫色区域表示较合理区域(8.5%),白色区域表示不允许区域(0.9%)。The blue region indicates where the amino acid residues are in the favored regions (90.6%),the purple region indicates allowed regions (8.5%),and the white region indicates an outlier regions (0.9%).
分子对接结果得到的白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP1与化合物结合的结合常数代表两者结合所需的自由能,数值越小表明结合特性越强。根据分子对接结果共得到了3种可能与CcOBP1结合特性较强的小分子物质(表2),白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP1与γ-丁内酯可通过分子间作用力形成稳定的结构(图3A-C),主要通过范德华力和氢键进行结合;CcOBP1的Asn-122、Ala-121与γ-丁内酯通过氢键结合;Leu-119、Met-120、Arg-123、Leu-85、Ala-99通过范德华力结合;Phe-89通过碳磷键结合;Cys-118、Cys-103通过碳碳键结合。
白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP1与邻苯二甲酸二甲酯主要通过范德华力等作用力进行结合(图3D-F)。CcOBP1的Met-68通过磷硫键与邻苯二甲酸二甲酯结合;Leu-73、Leu-80、Leu-119、Ala-99、Ala-116、Ala-121、Met-67、Asn-122通过范德华力与邻苯二甲酸二甲酯结合;Cys-118、Arg-123与邻苯二甲酸二甲酯通过碳氢键结合;Leu-103、Tyr-64、Met-120、Phe-89与邻苯二甲酸二甲酯通过碳碳键和碳磷键结合。
白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP1与萘主要通过范德华力进行结合(图3G-I)。CcOBP1的Ala-99、Ala-116、Ala-121、Leu-73、Leu-80、Leu-85、Leu-119、Lsy-88、Asn-122、Arg-123与萘主要通过范德华力进行结合;Met-67、Met-68、Met-120、Cys-108、Cys-118、Thy-64、Phe-89通过碳碳键和碳磷键结合。
表2 可能与白蛾周氏啮小蜂结合的化合物及结合常数Table 2 Compounds and binding constants that may bind to CcOBP1
气味结合蛋白(OBPs)和化学感受蛋白(CSP)被认为是昆虫化学感受中信息素和气味物质的载体。这些蛋白通常位于触角、口器和其他化学感觉结构中。这两类蛋白质的成员最近已经在昆虫身体的其他部分被检测到,并且被指出与各种功能有关。在某些情况下,相同的蛋白质在触角和信息素腺中表达,因此在接收和传播相同的化学信息方面发挥着双重作用(Pelosietal.,2017)。在昆虫触角特异表达的气味结合蛋在很大程度上与昆虫行为有关。研究发现,在昆虫雄性触角特异表达的气味结合蛋白可能与性信息素的结合有关(巩中军等,2005);在雌性昆虫触角特异表达的蛋白可能与寻找寄主和选择产卵地有关(张婷等,2012;Zhangetal.,2011)。CcOBP1是白蛾周氏啮小蜂的气味结合蛋白,其在雌性白蛾周氏啮小蜂触角特异性表达。因此,推测CcOBP1可能会与白蛾周氏啮小蜂寄主所释放的挥发物结合,因为雌性白蛾周氏啮小蜂需要寻找合适的寄主产卵,因而需要有较强的感受能力去感知寄主所释放的挥发物。
图3 CcOBP1与小分子化合物对接结果Fig.3 Result of that docking of CcOBP1 with small molecule compoundsA:CcOBP1与γ-丁内酯相互作用的全过程;B:加了表面的CcOBP1与γ-丁内酯作用过程;C:CcOBP1与γ-丁内酯详细的作用过程;D:CcOBP1与邻苯二甲酸二甲酯相互作用的过程;E:加了表面的CcOBP1与邻苯二甲酸二甲酯的作用过程;F:CcOBP1与邻苯二甲酸二甲酯作用的详细过程;G:CcOBP1与萘相互作用的全过程;H:加了表面的CcOBP1与萘的作用过程;I:CcOBP1与萘详细的作用过程。A:The total appearance of CcOBP1 interacting with γ-butyrolactone; B:The reaction process of CcOBP1 with γ-butyrolactone added at the surface; C:The detailed reaction process between CcOBP1 and γ-butyrolactone; D:The total appearance of CcOBP1 interacting with dimethyl phthalate; E:The reaction process of CcOBP1 with dimethyl phthalate added; F:The detailed reaction process between CcOBP1 and dimethyl phthalate; G:The total appearance of CcOBP1 interacting with naphthalene; H:The reaction process of CcOBP1 with naphthalene added; I:The detailed reaction process between CcOBP1 and naphthalene.
本研究通过Swiss-Model建立了OBP1蛋白的同源模型,然后又与11种小分子物质进行了分子对接。对接结果表明,白蛾周氏啮小蜂OBP1可能与γ-丁内酯、邻苯二甲酸二甲酯和萘结合。
本课题组前期对美国白蛾蛹挥发物中的若干化合物进行了生物活性测定(Zhuetal.,2016)。触角电位结果表明,γ-丁内酯、邻苯二甲酸和萘都能引起白蛾周氏啮小蜂触角较明显的电位反应。基于Y型嗅觉仪结果显示,γ-丁内酯、邻苯二甲酸二甲酯和萘均对白蛾周氏啮小蜂具有明显的趋避作用。γ-丁内酯已经在其他的研究中被鉴定为植物挥发物(Moon & Shibamoto,2009;Sellietal.,2008),但γ-丁内酯在昆虫体内的作用尚无研究。邻苯二甲酸二甲酯经鉴定为植物挥发物(丁嘉文等,2015),且其对按蚊等昆虫具有较好的趋避作用,可以作为蚊虫的趋避剂(Karunamoorthi & Sabesan,2010;Vatandoosetal.,2008)。萘对赤拟谷盗TriboliumcastaneumHerbst等昆虫的生长发育有很大的影响,高浓度的萘可以使其致死(Pajarocastroetal.,2017),对白蚁等昆虫具有趋避作用(Aihetashametal.,2017)。
本研究结果表明,白蛾周氏啮小蜂CcOBP1与γ-丁内酯、邻苯二甲酸二甲酯和萘的结合特性较好,CcOBP1的功能可能与白蛾周氏啮小蜂的趋避效应相关。在白蛾周氏啮小蜂寻找寄主的过程中,寄主对白蛾周氏啮小蜂既有引诱作用又有趋避作用,二者是协同作用的。因此,白蛾周氏啮小蜂与寻找寄主相关的OBPs的功能既有趋避作用也有趋向作用。本研究结果表明,CcOBP1的功能为趋避作用,会对美国白蛾蛹中的一些挥发物产生趋避反应,这也是寄主与寄生性天敌协同进化的结果。但这一结果还需要进一步的验证,未来将通过荧光竞争结合实验进一步证明。